目录
- 色谱是一种重要的生物物理技术，它可以对混合物的成分进行分离、鉴定和纯化，用于定性和定量分析。
- 它是一种分离技术，在这种分离技术中，携带混合物的流动相与选择性吸收固定相接触而移动。
- 亲和层析是一种类型的液体色谱法用于样品成分的分离、纯化或特定分析。
- 它利用称为亲和力可逆生物相互作用或分子识别这是指吸引强制引起他们留在组合原子之间施加不同程度。
例如：用酶和抑制剂的，与抗体等抗原
- 它是由Pedro Cuatrecasas和Meir Wilcheck发现的。
亲和层析原理
- 固定相由一个支撑平台，在其上基板（配体）共价结合，在这样的方式，对于所述目标分子的结合是必要的反应性基团被暴露的。
- 由于物质的粗混合物通过色谱柱，用结合位点的固定化底物结合的固定相，而所有其它物质在柱的空隙体积中洗脱的物质。
- 一旦其它物质被洗脱，结合的靶标分子可以通过方法如包括在移动相中的竞争性配体或改变pH，离子强度或极性的条件下洗脱。
亲和层析的组件
- 矩阵
- 基质是一种惰性载体，配体可以直接或间接地与之偶联。
- 为了为矩阵有效，就必须具备一定的特点：
- 基质在化学和物理上应该是惰性的。
- 它必须不溶于生产过程中使用的溶剂和缓冲液
- 它必须在化学和机械上是稳定的。
- 它必须很容易地与配体或配体可以连接的间隔臂连接。
- 它必须表现出良好的流动性能，并有一个相对较大的表面面积用于附着。
- 最有用的基质材料是琼脂糖和聚丙烯酰胺。
- 间隔臂
- 它通过克服空间位阻的影响来改善配体与目标分子的结合。
- 配位体
- 它是指分子可逆的结合到特定的目标分子。
- 只有在知道要分离的大分子的性质后才能选择配体。
- 当激素受体蛋白被亲和层析纯化时，激素本身就是配体的理想候选。
- 对于抗体分离，抗原或半抗原可用作配体。
- 如果一种酶要被纯化，底物类似物、抑制剂、辅因子或效应物可以用作固定化配体。
步骤亲和色谱法
- 亲和介质在结合缓冲液中达到平衡。
- 样品是在有利于目标分子与互补结合物质(配体)特异性结合的条件下应用的。目标物质与配体特异性结合，但可逆，未结合的物质穿过色谱柱。
- 洗脱是通过改变pH，离子强度或极性具体进行，使用竞争性配体，或非特异性。靶蛋白在纯化，浓缩的形式回收。
- 亲和介质与结合缓冲液重新平衡。
这些事件可以概括为以下三个主要步骤:
- 柱的制备
- 柱上装有固体支撑物，如琼脂糖、琼脂糖、纤维素等。
- 根据所需的分离物选择配体。
- 间隔臂在配体和固体支持物之间附接。
- 加载示例
- 含有的物质的混合物溶液倒入洗提塔，并使其以控制的速率运行。
- 配体分子复合物的洗脱
- 靶物质是通过改变条件以有利于结合的分子的洗脱回收。
亲和层析的应用
- 亲和层析是分离和纯化特定产物最有效的方法之一。
- 它本质上是一种样品纯化技术，主要用于生物分子，如蛋白质。
其主要应用包括：
- 化合物的混合物的分离。
- 杂质去除或在纯化过程。
- 在酶化验
- 检测的底物
- 酶结合位点的研究
- 在体外抗原抗体反应
- 核酸单核苷酸多态性和突变的检测
亲和层析的优点
- 高特异性
- 目标分子可以以高纯度的状态下获得
- 单步净化
- 该基质可以快速地重复使用。
- 所述基质是固体，可方便地清洗和干燥。
- 得到高收率的提纯产品。
- 亲和层析也可以用来去除特定的污染物，如蛋白酶。
亲和层析的局限性
- 耗时的方法。
- 更多量的所需溶剂，其可以是昂贵的。
- 劳动强度大
- 非特异性吸附不能完全消除，只能尽量减少。
- 数量有限和固定配体的成本较高。
- 如果不调整所需的pH值，蛋白质就会变性。
参考
- (2018)。生物化学与分子生物学原理与技术(8编)。剑桥大学出版社:纽约。
- https://www.med.unc.edu/pharm/sondeklab/files/resource-files/protein-purification-handbooks/Affinity%20chromatography.pdf
- https://www.slideshare.net/poojakamble1609/affinity-chromatography-ppt
- https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/promo_NOT_INDEXED/General_Information/1/ge-affinity-chromatography.pdf
- https://www.slideshare.net/sagarsavale1/affinity-chromatography-56328075
- https://www.shodex.com/en/da1/09/0201.html
- https://www.slideshare.net/asimsami/affinity-chromatography-73800707
非常有帮助的内容，以明确基本的关于亲和层析