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胶原蛋白杂交肽染色是什么？
胶原蛋白是所有组织的主要建筑块，包括肌腱，韧带，角膜，软骨和骨骼，它是一种纤维，结构蛋白，由三个平行的左手左手左手多丙烯II型螺旋组成。胶原蛋白可以在发育过程中进行广泛的蛋白水解重塑胶原蛋白退化导致各种威胁性威胁性疾病，如骨癌（骨关节炎），心肌梗塞，肾小球炎和肺纤维化。它还可以用于检测胚胎骨骼变形和皮肤衰老。
传统的方法难以检测这些类型的胶原降解，因此设计了一种肽(胶原杂交肽，CHP)，杂交降解的胶原。拼贴杂交肽(Collage Hybridizing peptide, CHP)是一种人工合成的肽序列，由6到10个重复的Gyl-Xaa-Yaa氨基酸三联体单位组成，模仿天然的胶原序列。CHP肽具有高含量的脯氨酸和羟脯氨酸在Xaa-Yaa位置，使其具有形成三重螺旋构象的强烈倾向。
单体肽链通过与胶原链形成杂交的三螺旋结构，具有识别人体组织中变性胶原链的能力。这一机制是通过三螺旋链(Gly-Xaa-Yaa)和类似于DNA片段退火成互补DNA链的氢键链实现的。由于缺乏结合位点，CHP对完整的胶原分子的亲和力可以忽略不计。由于中性和亲水性，它对非特异性结合也是惰性的。
胶原杂交多肽染色的目的
检测并证明存在变性胶原蛋白的存在
胶原杂交肽染色原理
胶原蛋白杂交肽染色剂是一种使用的特殊污渍发育生物学组织学和组织病理学检测和证明胶原降解组织的存在。
CHP强烈可视化细胞基质通过胶原蛋白培养物中发芽的细胞的蛋白水解迁移降解。局部机械损伤可以通过CHP定量分子水平，包括评估细胞外基质水平中胶原组织的变性。它使用SDS-Page的应用允许在不使用Western Blotting技术的情况下可视化胶原乐队。
CHP在溶液中储存时缓慢地重新组装成三重螺旋，因此它不能与未折叠的胶原链杂交。因此，在使用前必须通过加热将其分离成单体。CHP形成三聚体(trimerization)需要一些时间，甚至在低浓度时需要几个小时，因为热离解的CHP可以作为一种活性链来杂交变性的胶原蛋白。
在稀释后在水浴中加热CHP在水浴中是理想的常用方案是加热CHP溶液（在稀释至所需浓度后），并将其快速将其释放到室温，然后立即施用靶向胶原蛋白基材，如下所述详细。在大多数应用（未提供）中可能需要加热块和冰水浴。
在实际应用中，生物素可用于亲和素/链霉亲和素介导的CHP检测。
试剂
- 肽粉
- 磷酸盐缓冲水
- 生物素
- 基础盐
胶原杂交肽染色的程序
- 将0.3 mg肽粉(Biotin CHP)溶解在1ml纯水或磷酸盐缓冲盐水(1x PBS)中
- 混合良好并离心，制备具有至少100μMCHP的储备溶液。（在4°C存储储存溶液）
- 取决于使用的浓度稀释股票溶液。例子;对于60μg粉末，溶解在400μl水或PBS中以获得浓度为50μm的储备溶液。
- 取决于测试的组织，嵌段用10％血清或5％BSA的样品，特别是当与抗体共染时。（对于某些组织类型，例如肾脏，可能需要使用标准试剂盒来阻断内源性生物素用于B-CHP染色。）
- 将PBS缓冲液中的CHP储备溶液稀释，平均稀释样品。
- 将稀释的CHP加热在水浴中，控制温度为80℃，5分钟
- 立即将加热的CHP放入MicroTube中的冰水浴中15-90秒，以避免用热量损坏组织样品。
- 立即离心冷却的微管，收集管内的冷凝物，并将溶液移液到每个样本组织中。
- 用染色液在4°C下孵育2小时或过夜，效果更好。
- 在室温下在三种变化中洗涤组织在PBS中5分钟。
- 取决于样品污渍;
- CHP和R-CHP可以用荧光显微镜分析。
- B-CHP可以通过抗生物素蛋白/链霉蛋白介导的方法来检测。
胶原杂交肽染色的结果和解释
图:用B-CHP (AlexaFluor647-streptavidin检测，橙色)和抗胶原I抗体(alexafluor555标记的驴抗兔IgG H&L检测，青色)双染色的18 d.p.c.小鼠胚胎(E18)矢状切片上结合CHP的定位。mx,上颌骨;医学博士,下颌骨;英国石油(bp) basisphenoid骨;博,枕骨骨;vc,脊柱;rb,肋骨;h,臀骨;d、数字的骨头。图片来源:https://doi.org/10.1021/acsnano.7b03150
F-CHP,观察绿色染色的分离猪韧带冷冻切片。
R-CHP,加热的韧带会出现红色，而完整的韧带出现着蓝色，并且未加热的韧带深蓝色（黑色）。
对于B-CHP，韧带呈浅棕色。
胶原杂交多肽染色的优点
- 它是用于变性的单体胶原股的特异性。
- 它对变性的胶原韧带具有高度的敏感性
胶原杂交肽染色的缺点
- 如果将其储存在低浓度和非常低的温度下，则CHP将恢复到三聚体上
胶原杂交肽染色的应用
- CHP探针可应用于其他种类的生物
- CHP可用于区分胶原蛋白类型
- CHP用于检测炎症和组织损伤
- CHP用于检测胚胎骨骼变形
- CHP可用于检测皮肤老化
- CHP用于骨关节炎、肺纤维化、心肌梗死、肾小球肾炎的检测。
参考资料和来源
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