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什么是共聚焦显微镜?
- 共聚焦显微镜的概念最初是由马文·明斯基于20世纪50年代在哈佛大学提出的，目的是在不染色组织的情况下观察神经网络，但由于缺乏足够的光源和存储大量数据的计算机化系统，该概念没有取得成果。
- 这项工作后来被David Egger M.和Mojmir Petran改编，在20世纪60年代末形成了多光束共聚焦显微镜。他们使用一种名为Nipkow的旋转圆盘来检查未染色的脑组织和神经节细胞。这项技术后来被埃格改进并发表，形成了一种机械扫描共聚焦激光显微镜，能够将细胞的图像可视化。
- 后来科学的发展，包括计算机和激光技术的发展以及使用算法对图像进行数字处理，促进了共聚焦显微镜的进步，由G. Fred Brakenhoff(1979)、Colin Sheppard、Tony Wilson、Brad Amos和John White(1980)等一系列科学家形成了实际可用的共聚焦显微镜。
- 第一台商用共聚焦显微镜于1987年研制成功，改进了光学和电子技术，具有强大的激光和高扫描效率。
- 现代共聚焦显微镜具有所有可能的技术和机械部件的集成，包括光学部件，这些部件通过使用电子探测器、计算机和激光系统来执行配置的主要功能。
- 共聚焦显微镜的功能是其所有部件产生电子图像的共同作用。迄今为止，这些显微镜已被用于研究分子、微生物细胞和组织。
共聚焦显微镜的价格从50万美元到100万美元不等。
图:蔡司共聚焦显微镜。图片来源:蔡司
共聚焦显微镜的原理
- 通常，传统的(宽视场)显微镜使用来自光源的不同波长来可视化和照亮样本的大片区域，形成模糊、模糊和拥挤的图像，因为细胞样本图像是从各个方向捕捉的，没有一个焦点。
- 为了避免这些问题，使用共聚焦显微镜。在广角显微镜或荧光显微镜中，整个标本接受光，接受完全激发并发出光，这些光由显微镜上的光电探测器探测到。然而，在共聚焦显微镜下，点照明是主要的工作机制。
- 用荧光染色的标本进行检查。当一束光聚焦在荧光染色标本的某一点上时，它产生的照度被物镜聚焦到物镜上方的平面上。物镜在其上方的焦平面上有一个孔径，其主要作用是阻止任何杂散光到达标本。
- 照明点的测量值是直径约0.25至0.8 um，由客观数值孔径决定，深度0.5至1.5 um，亮度最高。
- 标本通常位于相机镜头和完美焦点之间，被称为焦点平面。使用来自显微镜的激光，激光扫描样品的一个平面(光束扫描0或通过移动工作台(工作台扫描)。然后，探测器将测量照明，产生光学部分的图像。扫描几个光学切片，将它们作为数据收集在计算机系统中，形成3D图像。图像可以被测量和量化。
- 它的结果也受到物镜上方的光圈的影响，光圈可以阻挡杂散光。
- 由共聚焦显微镜产生的图像具有非常好的收缩和分辨率能力，尽管标本的厚度。图像存储在细胞复合体的高分辨率3D图像中，包括其结构。
- 共聚焦显微镜的主要特点是，它只检测被聚焦的东西，而聚焦点以外的任何东西都呈现黑色。
当显微镜扫描仪在两个高速振荡镜的控制下扫描聚焦光束穿过选定区域时，样品的图像就形成了。它们的运动是由检流计马达促进的。一面镜子将光束从左侧移动到右侧轴而第二面镜子将光束沿轴。在x轴上扫描后，光束迅速移动回起点开始新的扫描，这个过程被称为反激。在反激过程中不收集任何信息，因此焦点，即感兴趣的区域是由激光扫描仪照亮的。
共聚焦显微镜的部分
共聚焦激光扫描显微镜由以下几部分组成:
- 物镜
- 失焦平面
- 获得焦点平面
- 束器
- 探测器
- 共聚焦针孔(孔径)
- 激光
- 振荡器的镜子
共聚焦显微镜的类型
- 共聚焦激光扫描显微镜它使用几面镜子沿着标本的X轴和Y轴进行扫描，通过扫描和去扫描，然后图像通过针孔进入探测器。
- 旋转的磁盘,也被称为Nipkow圆盘，是一种共聚焦显微镜，它使用圆盘上的几个活动孔(针孔)在指定的平面上以平行的方式扫描光点，持续很长时间。与共聚焦激光扫描显微镜相比，时间越长，照明所需的激发能量越少。激发能的降低降低了光毒性和光漂白，因此主要用于对活细胞成像。
- 双纺丝盘即微透镜增强共聚焦显微镜，是横河电机发明的;它的工作原理类似于旋转盘，唯一的区别是，它有第二个带有微透镜的旋转盘，在包含针孔的旋转盘之前找到。微透镜捕捉光的宽频带，将其聚焦到每个针孔中，从而增加了射入每个针孔的光量，减少了被旋转圆盘阻挡的光量。这些增强微透镜的共聚焦显微镜比旋转圆盘更灵敏。
- 可编程阵列显微镜(PAM)这种共聚焦显微镜使用空间光调制器(SLM -一种对光束施加某种形式的空间变化调制的物体)。SLM有一组可移动孔径(针孔)，带有不透明度、反射率或旋光性像素阵列。SLM还配有微电化学反射镜，通过电荷耦合器件(CCD)相机捕捉图像。
每一种共聚焦显微镜都有其优缺点，但它们都是通过记录图像来捕获图像，有时它们还可以通过编程获得高密度图像，特别是程序阵列显微镜和旋转盘共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜的应用
共聚焦显微镜用于广泛的领域，包括生物医学科学，细胞生物学，遗传学，微生物学，发育生物学，光谱学，纳米科学(纳米成像)和量子光学。
- 在生物医学科学中，它被用于分析角膜感染，通过定量和定性分析角膜内皮细胞。
- 用于鉴别角膜基质中真菌元素的存在，在角膜角菌病感染期间，或快速诊断和快速治疗反应。
- 它用于制药工业，以确保薄膜药品的维护，允许控制质量和药品分配的均匀性。
- 它用于从一些三维光学存储系统中检索数据。这有助于量化抹大伦纸莎草纸的年代。
优势
- 共聚焦显微镜的优点是它改善了图像的结果，因为它从一个光学点分析图像到另一个光学点，因此没有来自标本其他部分的散射光的干扰。
- 他们有更好的分辨率，每个感兴趣的点都是可视化和捕获的。
- 它可用于研究活细胞和固定细胞
- 它可以用来收集串行光学切片。
- 它均匀地照射在焦点上。
- 它们通过电子方式调整放大率，而不改变目标，通过一种被称为变焦系数的因子。
- 它生成3D图像集。
限制
- 它们的激发波长有限，波段非常狭窄。
- 制造共聚焦显微镜所使用的紫外线是非常昂贵的
- 它们的制造和购买成本也很高。
参考资料和来源
- https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/
- https://www.britannica.com/technology/microscope/Confocal-microscopes
- https://ibidi.com/content/216-confocal-microscopy
- https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/
- https://en.wikipedia.org/wiki/Spatial_light_modulator
- https://en.wikipedia.org/wiki/Confocal_microscopy