DNA测序- Maxam-Gilbert和Sanger二脱氧法

  • DNA测序是指确定一个分子中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的核苷酸基顺序的方法DNA
  • 第一个DNA序列是由学术研究人员在20世纪70年代早期使用基于2维色谱的实验室方法获得的。
  • 随着自动化分析染料测序方法的发展,DNA测序变得更加简单和快速。

DNA测序

DNA测序有两种广为人知的方法:

  1. 化学方法(以其发明者的名字命名,也被称为马克西姆-吉尔伯特法)。
  2. 链终止法(也被称为桑格二脱氧法,以其发明者命名)。
  • Maxam-Gilbert技术依赖于不同核苷酸键的相对化学性质,而桑格方法通过在序列中加入双脱氧核苷酸来中断DNA序列的延伸。
  • 链终止法因其速度快、简单而更常被使用。

化学解理法(Maxam-Gilbert法)

  • 1976-1977年,Allan Maxam和Walter Gilbert开发了一种基于DNA化学修饰和随后在特定碱基上切割的DNA测序方法。
  • 这种方法需要在一端贴上放射性标签,然后提纯DNA片段进行测序。
  • 化学处理会在四种反应(G, a +G, C, C+T)中每一种碱基中的一个或两个碱基上产生小比例的断裂。
  • 因此,从放射标记端到每个分子的第一个“切割”位点,产生了一系列标记片段。
  • 四种反应中的片段在凝胶电泳中并排排列以进行粒度分离。
  • 为了使碎片可视化,凝胶被暴露在x射线薄膜中进行放射自显影,产生一系列黑带,每个黑带对应于放射标记的DNA片段,从这些黑带可以推断出序列。

关键特性

  • 特定化学物质对DNA的碱基特异性切割
  • 四种不同的化学物质,每个碱基对应一种
  • 一组大小不同的DNA片段
  • DNA片段包含多达500个核苷酸

优势

  • 纯化的DNA可以直接读取
  • 同聚DNA序列的测序效率与异质DNA序列一样高
  • 可用于分析DNA蛋白质相互作用(即足迹)
  • 可以用来分析核酸结构和DNA的表观遗传修饰吗

缺点

  • 它需要大量使用危险化学品。
  • 它有一个相对复杂的设置/技术复杂性。
  • 它很难“放大”,不能用于分析超过500个碱基对。
  • 由于不完全裂解反应,读取长度减小。
  • 基于Maxam-Gilbert测序的DNA试剂盒很难制作。

链终止法(桑格二脱氧法)

链终止法(桑格二脱氧法)

  • 与Maxam和Gilbert法相比,链终止法效率更高,使用的有毒化学物质更少,放射性含量更低。
  • 桑格方法的关键原理是使用二脱氧核苷酸三磷酸(ddNTPs)作为DNA链终止物。
  • 链终止法需要单链DNA模板,DNA引物,DNA聚合酶,放射性或荧光标记的核苷酸,以及终止DNA链延伸的修饰核苷酸。
  • DNA样本被分成4个单独的测序反应,包含所有4个标准的脱氧核苷酸(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)和DNA聚合酶。
  • 在每个反应中只加入4个二脱氧核苷酸(ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)中的一个,这4个二脱氧核苷酸是链的终止核苷酸,缺少一个3 ' -OH基团来在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,从而终止DNA链的延伸,产生不同长度的DNA片段。
  • 新合成和标记的DNA片段经过热变性,并在变性的聚丙烯酰胺-尿素凝胶上通过凝胶电泳按大小分离,四种反应分别在四个单独的通道(a、T、G、C通道)中的一个进行。
  • 然后,DNA条带通过放射自显影或紫外光显示出来,DNA序列可以从x射线胶片或凝胶图像中直接读出。
  • 条带上的暗带表明DNA片段是二脱氧核苷酸(ddATP, ddGTP, ddCTP或ddTTP)合并后链终止的结果。
  • 然后根据四个通道中不同条带的相对位置(从下到上)来读取DNA序列。
  • 链终止测序的技术变化包括用含有放射性磷的核苷酸进行标记,或使用在5 '端用荧光染料标记的引物。
  • 染料引物测序有利于光学系统的读取,从而实现更快、更经济的分析和自动化。

桑格双脱氧法方法

关键特性

  • 利用二脱氧核苷酸终止DNA合成。
  • DNA合成反应在四个独立的试管中进行
  • 放射性dATP也包含在所有的试管中,因此DNA产物将具有放射性。
  • 产生一系列DNA片段的,其大小可通过电泳测定。
  • 每个片段的最后一个碱基都是已知的。

优势

链终止法极大地简化了DNA测序。

限制

  • 引物与DNA的非特异性结合,影响DNA序列的准确读出。
  • 影响序列保真度的DNA二级结构。

DNA测序的意义

  • 通过DNA测序获得的信息使理解或改变基因的功能成为可能。
  • DNA序列分析显示了控制基因表达的调控区域和基因“热点”特别容易发生突变。
  • DNA序列的比较显示了进化关系,为包括病毒在内的微生物的明确分类提供了框架。
  • 比较DNA序列有助于确定保守区域,这有助于开发特异性杂交探针,以检测临床样品中的微生物包括病毒。
  • DNA测序已经变得足够快和便宜,可以在实验室测定微生物序列,以鉴定微生物。16S核糖体亚基的测序可用于鉴定特定的细菌。病毒测序可用于识别病毒和区分不同毒株。
  • DNA测序显示基因结构,有助于研究人员发现基因产物的结构。

参考文献

  1. 大卫·海姆斯和奈杰尔·胡珀(2005)。生物化学。第三版。泰勒和弗朗西斯集团:纽约。
  2. 贝利,史考特,菲戈尔德,S. M.,巴伦,E. J.(1986)。贝利和斯科特的诊断微生物学。圣路易斯:处于。
  3. http://library.umac.mo/ebooks/b28050393.pdf
  4. http://www.aun.edu.eg/molecular_biology/Proceeding_Dec2011/DNA%20sequencing.pdf
  5. https://ab.inf.uni-tuebingen.de/teaching/ws09/bioinformatics-i/10-sequencing.pdf
  6. http://www.pathologyoutlines.com/topic/molecularpathdnaseqmaxam.html

对“DNA测序- Maxam-Gilbert - Sanger双脱氧法”的2个思考

  1. 做得很好——但是桑格方法下的彩色图表把-凝胶标注错了——更具体地说——看看图中的凝胶底部——底部的核苷酸——从左到右依次为C,T,A,G——但是——应该是- G,A,T,C——然后凝胶读通对应的是通道——!

    除此之外,做得非常好!

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