真核DNA隔离方案

• 脱氧核糖核酸（DNA）提取是将DNA与蛋白质，膜和含有其中所含细胞中所含的细胞材料分离的方法。
• 在真核细胞（如人和植物细胞）中，DNA被组织为称为细胞核的细胞器中的染色体。
• 这些细胞还具有脂质双层外膜和含有蛋白质，糖，脂质和各种类型的无机离子的细胞质。真核细胞还含有称为细胞器的其他膜封闭隔室。
• 因此，为了从这些细胞中分离DNA，所需的三个基本步骤包括：

1）裂解

2）降水

3）纯化

真核DNA分离原理

DNA分离中的第一步是细胞裂解，其中细胞和细胞核被打开，以释放内部的DNA。这可以实现是机械破坏方法（使用组织均化器（如小搅拌机），砂浆和杵，通过将组织切成小块）或通过使用洗涤剂和诸如蛋白酶K的酶如蛋白酶释放DNA和溶解细胞蛋白。萃取缓冲液通常在由50mm Tris，pH8,25mm EDTA，200mM NaCl，1％SDS等中的方法中使用。

• TRIS缓冲区有助于pH维护。
• EDTA结合可形成盐与阴离子PO43- DNA组盐的二价金属离子（Ca2 +，Mg2 +，Mn2 +）。它还破坏了细胞膜，防止DNA沉淀并抑制DNAsease。
• NaCl有助于松开细胞壁以增加DNA的溶解度和稳定性。它还使DNA能够从醇溶液中沉淀出来，因为它屏蔽了DNA的负磷酸盐末端，导致DNA股在一起更靠近。
• 作为阴离子洗涤剂的SDS破坏了蛋白质之间的离子相互作用。
• 液体洗涤剂导致细胞膜通过乳化细胞的脂质和蛋白质来破裂并破坏将细胞膜的粘合粘合在一起。洗涤剂还导致脂质和蛋白质沉淀出溶液。
• 从中断细胞中释放的DNA通过冷的绝对乙醇或异丙醇沉淀出来。
• DNA可溶于洗碗洗涤剂溶液，但如果加入乙醇，则不溶于溶解。添加酒精沉淀DNA，即它导致滤液中的每个组分保持在除DNA之外的溶液中。

真核DNA分离的材料和试剂

• 5ml微量纤维管
• 水浴80.^O.C
• 异丙醇（室温）
• 70％乙醇（室温）
• 裂解解决方案
• RNase解决方案
• 蛋白质沉淀溶液
• 吸收纸

真核DNA分离的程序

1. 取决于手的样品（动物细胞或植物细胞），进行细胞裂解。
2. 向裂解物中加入3μlrnase溶液
3. 反转管2-5次混合样品
4. 在37℃孵育混合物^O.C（15-30分钟）
5. 冷却到室温约5分钟
6. 加入200μl蛋白沉淀溶液和涡旋，高速（20秒）。
7. 寒冷样本约5分钟
8. 以13,000-16,000 x g离心（4分钟）
9. 在形成白色颗粒上，取出上清液。
10. 将DNA转移1.5mL微量离心管W /600μlOF室温。将异丙醇加入管中进行沉淀。
11. 倒置管轻轻搅拌溶液。
12. 白色螺纹 - 类似DNA的股线形成可见的质量
13. 以13,000-16,000 x g离心（室温1分钟）
14. 在形成小白色颗粒上，倾覆上清液
15. 加入100μl房间Temp.70％乙醇
16. 转换管几次（洗涤DNA）
17. 离心为13,000-16,000 x G（室温为1分钟）
18. 吸气乙醇
19. 倒置管在干净的吸收纸上
20. 风干颗粒（10-15分钟）
21. 加入100μL的DNA再水解溶液
22. 孵育在65.^O.C持续1小时（DNA的再水解）
23. 储存DNA（2-8^O.C）
24. 可以测定DNA浓度，测量用分光光度计测量600nm处的溶液的吸光度强度，并与已知的DNA浓度的标准曲线进行比较。DNA在260和280nm处吸收UV光，而蛋白质在280nm处吸收紫外光。

真核DNA分离的预期结果

白线像股线或白色颗粒的DNA

在分光光度法上，

• 纯DNA = 1.8
• DNA与蛋白质<1.8

参考

1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3037944
2. https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/dna-extraction.
3. https://bioprep.community.uaf.edu/learning-modules/2-dna-extraction-4/the-basics-of-dna-extraction/
4. https://www.scribd.com/doc/21423188/isolation-of-dna.
5. https://www.encyclopedia.com/science-andochnology/biology-andegetics/genetics-andegetics/ginering/dna-isolation-methods.
6. https://www.scribd.com/document/44958187/dna-extraction.
7. http://virtuallibrary.stao.ca/sci-tie-data/lessons/biology/b12/dna_extraction_experimentans.html.