流式细胞术-定义，原理，部件，步骤，类型，用途

流式细胞仪定义

• 流式细胞术是一种基于激光的标准技术，用于检测和测量非均匀流体混合物中的细胞或粒子的物理和化学特性。
• 流式细胞术的使用多年来增加，因为它提供了快速分析细胞的多种特征（定性和定量）。
• 可以通过该方法测量的性质包括粒子的尺寸，粒度或内部复杂性和荧光强度。
• 使用光学到电子耦合系统确定这些特性，所述光学电子耦合系统基于由细胞散射的激光来检测小区。
• 流式细胞仪，尽管它的名字，不一定处理细胞;它经常处理细胞，但它也可以处理染色体或者可以悬浮在液体中的分子或许多其他粒子。

流式细胞仪原理

流式细胞术的基本原理基于由颗粒散射的光的测量，并且当这些颗粒通过激光束时观察到荧光时观察到的荧光。

图：公共流式细胞仪的示意图，示出了流体，光学和电子系统。图像来源：AAT Bioquest公司。

光散射

• 当粒子使入射的激光偏转时，就会产生光散射。这种情况发生的程度取决于粒子的物理性质，即它的大小和内部复杂性。
• 前向散射光(FSC)与细胞表面积或细胞大小成正比。它主要用于测量衍射光，并检测出由光电二极管沿前向分散的入射激光束轴线方向的光线。
• 侧散射光(SSC)反映了细胞的粒度或细胞内部的复杂性。SSC是对发生在细胞内任何折射率发生变化的界面上的大部分折射和反射光的测量。
• FSC和SSC的测量用于不同均相细胞群中细胞类型的分化。

荧光

• 用于检测系统中细胞分子如蛋白质或核酸的表达的荧光标记物。
• 荧光化合物在一系列具有该化合物的波长范围内吸收光能。
• 这种光的吸收导致荧光化合物中的电子升高到更高的能级。
• 被激发的电子迅速衰减到基态，以荧光的形式释放出多余的能量，然后被探测器收集。
• 在混合细胞群中，可以使用不同的荧光染料来区分单独的亚步骤。
• 每种亚潜水病的荧光模式与FSC和SSC数据结合，可用于鉴定样品中存在哪些细胞并计算其相对百分比。
• 然后，电子系统将检测到的光信号转换为可以由计算机处理的电子信号。

流式细胞仪的仪器/部分

流式细胞仪由三个主系统组成：流体，光学系统和电子系统。

流体化

• 流体系统的目的是将流体中的粒子输送到激光束中。为了完成这一任务，样品被注入流动腔内的鞘状流体(通常是缓冲的盐水溶液)。
• 流动室的设计允许样品芯聚焦在鞘液的中心，其中激光束与颗粒相互作用。
• 通过将样品悬浮液注入鞘液流的中心来实现聚焦。鞘流体的流动移动颗粒并将它们限制在样品芯的中心。

光学系统

• Cytometer的光学系统由激励光学和集合光学组成。
• 激发光学由激光和透镜组成，用来塑造和聚焦激光束到样品的流动。
• 收集光学器件包括收集透镜，以收集在颗粒与激光束相互作用之后发射的光，以及将所收集的光的指定波长的光学反射镜转移到指定的光学检测器。
• 在电池或粒子通过激光之后，在侧面发射的光线和荧光信号被引导到光电倍增管（PMT），并且光电二极管收集信号。
• 为了实现检测器对特定荧光染料的专一性，在管的前面放置一个过滤器，它只允许很窄的波长范围到达检测器。

电子系统

• 电子系统将来自探测器的信号转换为可以由计算机读取的数字信号。
• 一旦光信号撞击PMT或光电二极管的一侧，它们就被转换成乘以形成更大的电流的相对电子电流。
• 电流移动到放大器并被转换成电压脉冲。
• 当颗粒撞击光束的中心时，实现了脉冲的最高点，在这种情况下，实现了最大散射或荧光量。
• 然后模数转换器(ADC)将脉冲转换为数字数字。

流式细胞术的协议/程序/过程/步骤

流式细胞术的过程包括以下内容：

样品制备

• 在流式细胞仪中运行之前，在分析中的细胞必须处于单细胞悬浮液中。
• 通过使用酶促消化或组织的机械解离，将首先将固体器官中存在的固定培养细胞或固体器官中存在的细胞转化为单个细胞悬浮液。
• 然后是机械过滤应避免不需要的仪器堵塞并获得更高质量的流量数据。
• 然后将所得细胞与未标记的或荧光缀合的抗体一起孵育在试管或微量滴定板中，并通过流式细胞仪机进行分析。

抗体染色

• 一旦样品制备，细胞涂覆有针对存在于不同细胞上存在的表面标志物的荧光色谱缀合的抗体。这可以通过直接，间接或细胞内染色来完成。
• 间接染色，将细胞与直接与荧光团缀合的抗体一起温育。
• 在间接染色中，荧光团标记的二抗检测一抗
• 细胞内染色程序允许直接测量细胞细胞质或细胞核内的抗原。为此，首先使细胞渗透，然后用渗透缓冲液中的抗体染色。

运行样本

• 首先，运行控制样品来调整探测器中的电压。
• 设定细胞仪中的流速并运行样品。

流式细胞术的类型

基于该过程的目的和精度，有不同类型的流式细胞计：

1. 传统的流血细胞计数器

• 传统的流式细胞仪是常用的利用鞘液对样品流进行聚焦的流式细胞仪。
• 传统流式细胞计中使用的最常见激光器为488nm（蓝色），405nm（紫色），532nm（绿色），552nm（绿色），561nm（绿色黄色），640nm（红色）和355nm（紫外线）。

2. 声学聚焦细胞计

• 在这些细胞计中，超声波用于将电池聚焦到分析。
• 这可以防止样品堵塞，并且还允许更高的采样输入。

3. 细胞分类器

• 细胞分选器是一种传统流式细胞计的类别，其允许用户在加工后收集样品。
• 对于所需参数的阳性是阳性的细胞可以与参数负的那些分离。

4. 成像流动含细胞仪

• 成像细胞计是传统的细胞计脑与荧光显微镜结合。
• 成像细胞仪允许在单个细胞和群体水平上快速分析样品的形态学和多参数荧光。

应用/用途

流式细胞术用于包括分子生物学，病理，免疫学，病毒学，植物生物学和海洋生物学的若干领域。一些常见应用程序包括：

• 它用于临床实验室，用于检测白血病等体液中的恶性肿瘤。
• 细胞分选仪可以用细胞分选仪在单独的收集管中分离感兴趣的细胞。
• 它可用于检测内容脱氧核糖核酸通过使用荧光标记物。
• 流式细胞计允许通过使用荧光染料进行细胞周期四个不同阶段的复制细胞分析。
• 声学流式细胞仪用于血液和其他样本中多药耐药菌的研究。
• 流式细胞计基于形态学和生物化学变化的差异，可以检测细胞死亡，细胞凋亡和坏死的不同阶段。

限制

• 这个过程并不提供关于细胞内蛋白质位置或分布的信息。
• 随着时间的推移，碎片被汇总，这可能导致错误的结果。
• 与样品制备和染色相关的预处理是耗时的过程。
• 流式细胞仪是一种昂贵的过程，需要高素质的技术人员。

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