荧光显微术。定义、原理、部件和用途

什么是荧光显微镜?

一个荧光显微镜是一种利用荧光和磷光来代替或除反射和吸收外研究有机或无机物性质的光学显微镜。荧光是一种吸收了光或其他电磁辐射的物质发出的光,而磷光是一种与荧光有关的特定类型的光致发光。与荧光不同,磷光材料不会立即重新发射它吸收的辐射。荧光显微镜是在20世纪早期发明的Köhler,卡尔·赖彻特和海因里希·莱曼等人。

荧光显微镜原理

大多数细胞成分是无色的,在显微镜下不能清楚地分辨。荧光显微镜的基本前提是用染料对组分进行染色。

荧光染料,也被称为荧光团或荧光色素,是一种分子,吸收给定波长(一般是UV)的激发光,并在短时间延迟后,发出较长波长的光。吸收和发射之间的延迟可以忽略不计,通常在纳秒量级。

然后发射的光可以从激发光中过滤出来,以揭示荧光团的位置。

荧光显微镜

  • 荧光显微镜使用更高强度的光来照射样品。这种光激发样品中的荧光物质,然后发出更长的波长的光。
  • 产生的图像基于第二光源或荧光物种的发射波长,而不是最初用于照亮和激发样品的光。

工作

激发波长的光通过物镜聚焦在试样上。标本发出的荧光被物镜聚焦在检测器上。由于大部分激发光通过试样透射,只有反射的激发光与发射的光一起到达物镜。

形式

“荧光显微镜”指的是任何利用荧光产生图像的显微镜,无论是像epifluorescence显微镜那样更简单的设置,还是像共聚焦显微镜那样使用光学切片来获得更好的荧光图像分辨率的更复杂的设计。

使用中的大多数荧光显微镜是epi荧光显微镜,荧光团的激发和荧光的检测通过相同的光路(即通过物镜)完成。

荧光显微镜部件

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荧光显微镜的典型部件有:

  • 荧光染料(荧光团)
    • 荧光团是一种荧光化合物,可以在光激发下重新发光。
    • 荧光团通常包含几个结合的芳香基团,或带有几个π键的平面或环状分子。
    • 许多荧光染色剂都是为一系列生物分子设计的。
    • 其中一些是本质上具有荧光的小分子,并与感兴趣的生物分子结合。主要的例子是核酸染色,如DAPI和Hoechst, phalloidin,用于染色哺乳动物细胞中的肌动蛋白纤维。
  • 一个光源
    • 使用四种主要类型的光源,包括带有激励过滤器的氙弧灯或汞蒸气灯、激光器和高功率led。
    • 激光器主要用于复杂的荧光显微镜技术,而氙灯、汞灯和带有二向色激励滤波器的led通常用于宽场epifluorescence显微镜。
  • 激发过滤器
    • 激励器通常是一个带通滤波器,只通过被荧光团吸收的波长,从而最大限度地减少其他荧光源的激发,并阻断荧光发射带中的激发光。
  • 二向色镜的
    • 二向色滤光片或薄膜滤光片是一种非常精确的滤色片,用于选择性地通过小范围颜色的光,同时反射其他颜色。
  • 排放过滤器。
    • 发射器是典型的带通滤波器,它只通过荧光团发射的波长,并阻挡该带外所有不希望看到的光——尤其是激发光。
    • 通过阻挡不必要的激发能量(包括紫外线和红外)或样品和系统的自动荧光,光学过滤器确保最黑暗的背景。

荧光显微镜的应用

  • 在固定和活的生物样本中识别结构。
  • 荧光显微镜是当今生命科学研究的常用工具,因为它允许使用多色染色,标记细胞内的结构,并测量细胞的生理状态。

荧光显微镜的优点

  1. 荧光显微镜是研究活细胞成像动态行为的最常用方法。
  2. 这源于其在非荧光材料中分离出具有高度特异性的单个蛋白质的能力。
  3. 灵敏度高到每立方微米可以检测到50个分子。
  4. 不同的分子可以染色不同的颜色,可以同时跟踪多种分子。
  5. 这些因素使荧光显微镜在体外和体内成像方面比其他光学成像技术具有明显的优势。

荧光显微镜的局限性

  • 荧光团在被光漂白的过程中失去发出荧光的能力。光漂白发生在荧光分子积累化学损伤的电子激发荧光。
  • 细胞易受光毒性的影响,尤其是短波长的光。此外,荧光分子在光照下有产生活性化学物质的趋势,这增强了光毒性效应。
  • 不像透射和反射光学显微镜荧光显微技术只允许观察荧光标记的特定结构。

参考文献

  1. https://www.slideshare.net/doctorrao/fluorescent-microscopy
  2. https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope
  3. https://www.slideshare.net/VIVEKKUMARSINGH109/fluorescence-microscopy-72205439
  4. https://www.mscience.co.nz/view/cell-biology/fluorescence-microscopy
  5. https://www.semrock.com/introduction-to-fluorescence-filters.aspx
  6. https://www.olympus-lifescience.com/es/microscope资源/底漆/技术/荧光/过滤器/

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