荧光显微镜定义,原理,零件,用途

荧光显微镜的定义

  • 一个荧光显微镜是一种光学显微镜,利用荧光和磷光代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。
  • 荧光是由吸收光或其他电磁辐射的物质发出的光,而磷光是与荧光有关的一种特殊类型的光致发光。
  • 与荧光不同,磷光材料不会立即重新发出吸收的辐射。
  • 荧光显微镜是在20世纪早期由Köhler, Carl Reichert和Heinrich Lehmann等人发明的。

荧光显微镜

荧光显微镜原理

  1. 大多数细胞成分是无色的,在显微镜下不能清楚分辨。荧光显微镜的基本前提是用染料对组分进行染色。
  2. 荧光染料,也被称为荧光团或荧光染料,是一种分子,吸收给定波长的激发光(通常是紫外线),并在短延迟后发出更长波长的光。从吸收到发射之间的延迟可以忽略不计,一般在纳秒量级。
  3. 然后可以从激发光中过滤排放光以露出荧光团的位置。
  • 荧光显微镜使用更高的强度光来照亮样品。该光激发样品中的荧光物质,然后发出较长波长的光。
  • 产生的图像是基于第二光源或荧光物种的发射波长,而不是最初用于照亮和激发样品的光。

在职的

激发波长的光通过物镜聚焦在样品上。标本发出的荧光被物镜聚焦在检测器上。由于大多数激发光都是通过样品透射的,只有反射的激发光与发射光一起到达物镜。

形式

“荧光显微镜”是指使用荧光产生图像的任何显微镜,无论是更简单的设置,如ePiforEcence显微镜,还是一种更复杂的设计,如共聚焦显微镜,它使用光学切片来获得更好的分辨率荧光图像。

使用中的大多数荧光显微镜是对杂荧光显微镜,其中通过相同的光路(即通过物镜)来完成荧光团的激发和荧光的检测。

荧光显微镜的一部分

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荧光显微镜的典型组分是:

  • 荧光染料(荧光团)
    • 荧光团是一种荧光化合物,可以在光激发时重新发光。
    • 荧光团通常包含几个结合的芳香基团,或有几个π键的平面或环状分子。
    • 许多荧光污渍已经设计用于一系列生物分子。
    • 其中一些是本质上荧光的小分子,并结合感兴趣的生物分子。这些主要实例是DAPI和Hoechst等核酸污渍,用于在哺乳动物细胞中染色肌动蛋白纤维。
  • 一个光源
    • 主要使用四种类型的光源,包括氙弧灯或带有激励滤波器的汞蒸气灯、激光和大功率led。
    • 激光主要用于复杂的荧光显微镜技术,而氙灯、汞灯和带有二色激励滤光片的led通常用于大视场荧光显微镜。
  • 励磁过滤器
    • 激励器通常是一个带通滤波器,它只通过被荧光团吸收的波长,从而最大限度地减少其他荧光源的激发,并在荧光发射带阻塞激发光。
  • 二向色镜子
    • 二向色滤光片或薄膜过滤器是一种非常精确的滤色器,用于在反射其他颜色的同时选择性地通过各种颜色的光。
  • 发射过滤器。
    • 发射极是典型的带通滤波器,它只通过由荧光团发出的波长,并阻挡该波段以外的所有不需要的光,特别是激发光。
    • 通过阻止不需要的激励能量(包括UV和IR)或样本和系统自发荧光,光学滤波器确保最黑暗的背景。

荧光显微镜的应用

  • 识别固定和实时生物样品中的结构。
  • 荧光显微镜是今天生命科学研究的常见工具,因为它允许使用多色染色,细胞内的结构标记,以及测量细胞的生理状态。

荧光显微镜的优点

  1. 荧光显微镜是研究活细胞成像中表现出展示的动态行为的最流行方法。
  2. 这源于其在非荧光材料中具有高度特异性的单个蛋白质的能力。
  3. 灵敏度足够高,以检测到每个立方千分尺的50分子少。
  4. 不同的分子现在可以染色用不同的颜色,允许同时跟踪多种类型的分子。
  5. 这些因素结合起来,使荧光显微镜在体外和体内成像方面比其他光学成像技术具有明显的优势。

荧光显微镜的局限性

  • 荧光团在被光漂白的过程中会失去荧光的能力。当荧光分子从荧光过程中激发的电子中积累化学损伤时,光漂白就发生了。
  • 细胞易于光毒性,特别是具有短波长光。此外,荧光分子在照射下产生反应性化学物质的趋势,这增强了光毒效应。
  • 不同于透射和反射光学显微镜技术,荧光显微镜只允许观察已标记为荧光的特定结构。

参考

  1. https://www.slideshare.net/doctorrao/fluorescent-microscopy
  2. https://en.wikipedia.org/wiki/fluorenty_microscope.
  3. https://www.slideshare.net/vivekkumarsingh109/fluorenth-microscopy-72205439.
  4. https://www.mscience.co.nz/view/cell-biology/fluorescent-microscopy.
  5. https://www.semrock.com/introduction-to-fluorescence-filters.aspx
  6. https://www.olympus-lifescience.com/es/microscope资源/底漆/技术/荧光/过滤器/

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