凝胶电泳系统-设备,零件,类型,示例

电泳是一种化学过程,其中溶液中的电荷流向相反的电极。20世纪30年代,瑞典生物物理学家Arne Tisselius在研究血液蛋白质时发明了电泳技术。1948年,Arne Tisselius因其对电泳技术的贡献而获得了诺贝尔化学奖。

凝胶电泳系统
凝胶电泳系统

凝胶电泳是一种基于电荷或大小分离DNA、RNA或蛋白质分子的实验室方法。

凝胶电泳原理

电泳原理是观察到大多数生物分子以带电粒子的形式存在,带有可电离的官能团。含有生物分子的溶液会有带正电或负电的离子,这取决于pH值。

当带电分子被置于电场中时,它们的运动方向与正极或负极相反。根据溶液中每个粒子的质量和净电荷,电离的生物分子在暴露于电场时将以不同的速率迁移。带负电荷的粒子如核酸会被吸引向阳极,而带正电荷的粒子则会被吸引向阴极。由于速度和方向的变化,每个带电粒子将以其特定特性所决定的模式迁移,从而使具有相似特性的生物分子组分得以分离。

凝胶电泳装置零件

电力供应

  • 电泳的条件是恒流、恒压或恒功率。
  • 应该使用稳定的电源来维持迁移速度。
  • 红色(阳极/正极)和黑色(阴极/负极)的导线连接电源到凝胶盒。
  • 这些电线将来自电源的电流输送到凝胶盒中。
  • 如果电流增加,通过电阻产生更多的热量,这导致溶解的离子热搅拌。
  • 设备中的水蒸发得更快。
  • 缓冲液中的离子浓度会因此上升。
  • 因为DNA和RNA是带负电荷的,所以黑线连接在盒子的后部,这使得它们可以移动到凝胶盒的前部,那里连接着带正电荷的红线。
凝胶电泳装置零件
图:凝胶电泳仪的部分部件。图片来源:克利弗科技有限公司

缓冲区

  • 缓冲液决定了体系的pH值和溶质上的电荷。
  • 理想的缓冲具有以下特性:
  1. 保持分析物的溶解能力
  2. 在整个分析过程中保持缓冲容量不变
  3. 它不应该阻止预期的分析物被检测到。
  4. 实现适当的分离范围

有两种类型的缓冲液酸性缓冲液和碱性缓冲液。对于较低的pH值,酸性缓冲液,包括柠檬酸,醋酸盐,甲酸盐和磷酸盐,被利用。基本的缓冲液,如丁三酸盐,硼酸盐和三辛盐被用来保持高pH值。

  • 缓冲液的价(离子强度)和质量摩尔浓度相等。因此它们是由一价离子组成的。
  • 准备好的缓冲液在不使用时应小心冷却,因为它们可以作为细菌生长的有利环境。
  • 在这个过程中可以使用冷缓冲液,因为它增加了样品的分辨率,减少了溶剂的蒸发。
  • 缓冲区可以在大容量中重复使用最多4次,但在小容量中,它可以立即丢弃。
  • 尽管由于产生的高热,破坏热不稳定化学品的风险很高,但缓冲液较高的离子强度有利于获得更清晰的分辨率。

支持媒体

  • 支撑介质包括淀粉、聚丙烯酰胺、琼脂糖和由醋酸纤维素制成的片状、板状和柱状膜。
  • 它是一种胶体,含有90%以上的水。
  • 它是分子分离的分子筛。
  • 小分子可以通过它,因为它是多孔的,而大分子不能。
  • 要求电中性。
  • 在进行电泳时,琼脂糖凝胶主要用作支撑介质。
  1. 淀粉凝胶
  • 这是第一个用于电泳的凝胶介质。
  • 它促进了基于电荷质量比和分子大小的蛋白质分离。
  • 通过在缓冲液中煮沸淀粉颗粒悬浮液制备胶体悬浮液,当允许冷却时,由于支链淀粉支链的缠绕形成半固体凝胶。
  • 凡士林的加入是为了避免膨胀和收缩。
  • 可以实现清晰的区域和高分辨率。
  • 由于凝胶制备的可重复性是一个挑战,目前没有使用。
  1. 醋酸纤维素
  • 当科恩展示如何分离红色中的血红蛋白时血细胞利用醋酸纤维素电泳技术首次发现了血清中异常血红蛋白。
  • 完全由纤维素制成的滤纸经乙酰化后可产生醋酸纤维素。葡萄糖环的C-3和C-6位置是乙酰化发生的典型位置。与琼脂糖和聚丙烯酰胺等其他常见的电泳基质相比,醋酸纤维素具有更大的孔隙。
  1. 琼脂糖
  • 从红海藻中分离出的琼脂含有琼脂糖,这是一种天然的线性聚合物,由半乳糖和3,6-无水半乳糖链组成。
  • 和琼脂一样,琼脂糖是作为干粉储存的。
  • 将琼脂糖粉溶解在适当的溶液缓冲液中,加热,冷却至室温,即可铸造琼脂糖凝胶。
  • 溶液缓冲液中的琼脂糖浓度控制凝胶的孔径。
  • 为了区分DNA和RNA分子,琼脂糖凝胶经常使用0.8% (W/V)到5% (W/V)。
  • 与聚丙烯酰胺凝胶相比,分辨率相对较低。
  • 它具有较低的成胶温度,中性电荷,形成稳定的凝胶。因此,它被认为是凝胶电泳的理想材料。它既可以是固体也可以是液体。
  1. 聚丙烯酰胺
  • 它是由丙烯酰胺单体在交联剂N, N-亚甲基-双丙烯酰胺(也称“双丙烯酰胺”)存在下共聚而成的透明透明凝胶。
  • 丙烯酰胺的浓度必须与其交联剂成比例,控制着聚丙烯酰胺凝胶中孔隙的大小。
  • 分离DNA和蛋白质通常需要少量的丙烯酰胺凝胶(3%-15%)。
  • 十二烷基硫酸钠(SDS)中的-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),蛋白质在变性条件下根据其大小分离,其中通常使用较高比例的丙烯酰胺凝胶(10%-20%)。

电泳室

  • 它是一种塑料容器或容器,填充缓冲以防止生物分子移动。
  • 它的透明盖子使它很容易看到迁移过程。
  • 它连着电源。

用于染色和去染色凝胶的容器

  • 凝胶染色和去染色可以使用托盘和容器完成。
  • 有盖盒和开式盒可供选择。
  • 它们通常有丙烯基。
  • 它们是透明的,紧密贴合。
  • 它们能抵抗化学药品和污渍。

电极

  • 两个铂电极有助于分离分子,因为它们能够吸引带相反电荷的电荷。
  • 正离子与阳极结合,而阴极与负离子结合。

凝胶浇铸器和梳子

  • 凝胶被倒入一个凝胶铸模中,铸模中含有凝胶,一旦凝胶溶解在溶剂中,就储存在仪器内部。
  • 用梳子将孔放置以准备样品加载。

类型的电泳

凝胶电泳有几种类型,即:

  1. 纸凝胶电泳
  2. 琼脂糖凝胶电泳
  3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
  4. 脉冲场凝胶电泳(PFGE)
  5. SDS页
  6. 2 d -电泳
  7. 火箭免疫电泳(电泳)
  8. 差异凝胶电泳

它们也被分为原生的和变性的,RNA或蛋白质在原生凝胶电泳中通过凝胶时保持其原生结构。相比之下,在变性凝胶电泳中,RNA或蛋白质被还原为凝胶电泳前或凝胶电泳中它们的线性结构。这种还原是通过在样品、凝胶和/或缓冲液中加入还原剂来实现的,它分离了RNA或蛋白质分子中的键,并导致二级结构的形成。

纸凝胶电泳

  • 它被用于在临床环境中调查血清和其他体液。
  • 不透明的和无毒的
  • 方便存储
  • 蛋白质吸附
  • 可怜的电导率
  • 背景染色
  • 纤维素的OH基团附着在蛋白质上,减慢了电泳运动,导致电泳轨迹的条带和分辨率较差。

琼脂糖凝胶电泳

  • 琼脂糖的浓度决定了电泳的分辨率。
  • 它适用于分离从100碱基对到20千碱基对的DNA片段。
  • 此外,它还适用于蛋白质的电泳分离。
  • 当使用低浓度的琼脂糖凝胶时,可以根据两性分子的等电点来分离两性分子,称为等电聚焦。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

  • 它的使用浓度高达3-30% (pH值范围:4-9.0):蛋白质分离所需的浓度高于DNA分离,反之亦然。
  • 更大程度的可靠性和准确的孔隙度。
  • 它在计算DNA分子量、DNA测序、研究DNA纯度、分析重组DNA分子和分离RNA分子、测量RNA分子量等方面都有应用。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)

  • 1984年,施瓦茨和康托介绍了这种方法。
  • 琼脂糖凝胶中的DNA分离是通过改变电极间电场的方向和强度来完成的。
  • 利用这种技术可以分离具有许多兆酶甚至整个染色体的高分子量DNA。
  • PFGE被应用于许多领域,因为它能产生精确的结果,有效地重现。
  • 它被应用于对食品中发现的病原体的分子生物学的研究,跟踪发酵过程中使用的有机体的遗传稳定性,绘制染色体重排检测、RFLP和DNA指纹等应用,以及在医院爆发疫情时识别关联菌株等。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

  • 最初被称为Laemmli方法,以其英国发明家U.K. Laemmli命名。
  • 上层堆积凝胶孔隙较大,pH为6.8,下层分离凝胶孔隙较小,pH为8。
  • SDS- page根据多肽链长度分离蛋白质,由于使用了十二烷基硫酸钠(SDS,也称十二烷基硫酸钠)和聚丙烯酰胺凝胶,很大程度上消除了结构和电荷的影响。
  • SDS是样品缓冲液中的一种清洁剂,它和一些还原性化学物质共同作用,通过破坏蛋白质的二硫键来破坏蛋白质的三级结构。
  • 它被用来计算蛋白质的分子量,并确定蛋白质样品是否纯净。

等电点与等电聚焦(IEF)

被称为等电点的pH值是指蛋白质没有净电荷(pI)的pH值。蛋白质被它们的等电点在一个连续的pH梯度中分离,使用高分辨率方法称为等电聚焦(IEF)。由于具有优异的分辨能力,pI相差仅0.01 pH单位的化合物可以被分离出来。

它被用来区分同工酶,分离蛋白质,并分离所有两性物质。

二维凝胶电泳

  • 它被用来分析复杂的蛋白质混合物,是作为2DGel, IEF和SDS-PAGE程序的混合而来的。
  • IEF在第一步将蛋白质分离成电荷,然后根据其质量在第二步进行分离。
  • SDS处理使IEF凝胶上分离的蛋白质带负电荷,将凝胶水平放置在SDS- page凝胶中进行电泳。
  • 因此,集中在pI上的蛋白质会根据分子量进行划分。

Immuno-electrophoresis(火箭电泳)

  • 在免疫电泳(IEP)过程中,首先用电泳在半固体介质中分离蛋白抗原,然后对抗血清进行免疫扩散生成沉淀素。
  • 将与待测试验抗原互补的合适抗体溶解在熔融琼脂溶液中,并放置在水平板上。抗原被注入凝胶上的孔中。Ag在碱性pH值下获得负电荷,向阳极方向移动,与Ab相互作用形成Ag-Ab络合物,并析出。一旦凝胶被CBB等合适的染料染色,免疫沉淀就会像火箭一样出现弧线。

差异凝胶电泳

  • 它的创建是为了解决差异表达研究的定量元素,并缓解2D-PAGE的一些问题,如分析波动。
  • 要分别查看每个蛋白质样本,最多可以用大小和电荷匹配的荧光染料标记三个不同的蛋白质样本(例如,Cy3, Cy5, Cy2)。将这三种样品组合,加载,并进行二维电泳。

操作程序电泳的

凝胶溶液制备凝胶是把它溶解在沸水中制成的。冷却到更舒适的温度后,将溶液倒入模具或铸锭中。

凝胶铸造凝胶凝固后,用梳子在凝胶中打孔。然后将凝胶插入电泳室。缓冲器填充腔室至其总容积的三分之一。

样品制备:为了确定样品的颜色和密度,添加负载染料,可以是荧光标记或溴化乙锭。

DNA被分离和预处理,并放置在含有一些基本蓝色染料的溶液中,以帮助可视化样本通过凝胶的运动。

示例加载:用一个干净的微移液管将样品装入孔中。

电泳:所述箱体和所设电压的电源分别由负极和正极连接。当电源打开时,就会产生电场和带负电荷的粒子。带负电荷的DNA会向阳极迁移,因为分子会被带相反电荷的电极所吸引。

停止电泳,染色和可视化:染料用于视觉上跟随迁移。电源被关闭。凝胶染色和可视化使用凝胶成像仪时,程序完成。通过比较样品碎片的大小与标准,用分子量的对数来计算它们的大小。

应用程序电泳的

  • 用DNA指纹技术分离DNA片段,用于调查犯罪现场和亲子鉴定。
  • 检测与健康和疾病有关的遗传变异和蛋白质。
  • 用于科学目的的核酸和蛋白质的检测和纯化。
  • 它有助于在血液、其他组织或食物等来源中发现病原体。
  • 它有助于蛋白质或核酸的鉴定和纯化,经常使用质谱或DNA测序进行更详细的检查。
  • 它被用于印迹法分析大分子和进化研究。
  • 便于对聚合酶链式反应(PCR)结果进行评价。
  • 疫苗的研发和生产都得益于电泳技术。
  • 为了区分物种和进化关系,进行了分类学- dna谱分析。

优势电泳的

  • 合理负担得起的。
  • 在相似的结果之间建立直接联系
  • 很容易操作
  • 可以检测任何证据的DNA。
  • 优越的决议
  • 可在广泛的孔径范围。
  • 在广泛的pH值,温度和离子强度范围内稳定
  • 透明的光
  • 化学惰性
  • 电中性和亲水性

限制电泳的

1.有限的样本分析

  • 基因表达可以用原位杂交(ISH)等方法在组织样本的每个小位置进行检测。
  • 使用ISH,研究人员可以检查样本中的每个大脑区域,而电泳方法只能对有限的部分区域进行检测。

2.测量并不精确

  • 凝胶电泳可以有效分离分子量相近的蛋白质。
  • 它还可以使用一种叫做2D电泳的方法更精确地分离蛋白质。
  • 在蛋白质被纯化后必须使用质谱法来确定蛋白质的精确质量。

3.需要大量的起始样品

  • 蛋白质的扩增与DNA和RNA在电泳前的扩增是不可行的。因此,需要大量的组织样本来进行这些检测,这降低了该技术的实用性,流式细胞术和免疫组化技术经常被用于分析单个细胞中的蛋白质表达。

4.有限的可视化工具

  • 电泳对测量小激素、神经递质和离子无效。
  • 由于两个问题,它们不会完全反应电泳制备(通常称为SDS-PAGE),即使它们反应了,它们也太小了,无法正确分离。它们会从凝胶底部冲出来。

5.低吞吐量

  • 低吞吐量指的是它不能快速生成数据。与PCR和流式细胞术相比,电泳在产生研究数据和建立复杂关系方面的能力较差。

预防措施

  • 建议使用不导电的地板和长凳(木制或塑料制成)。
  • 在电泳系统周围或附近操作时,避免意外的接地点和导体(如水槽和其他废物来源)。
  • 在加载样品时,避免用力推,因为它可能破坏井。
  • 在准备凝胶时戴上手套、口罩和护目镜。
  • EtBr具有致癌性和诱变性,因此在处理它之前要采取适当的预防措施。

例子电泳的系统

DNA电泳系统GEP-TH-1000TBT(生产商:Bioevopeak)

特性

  • 该系统具有内置大电流电源的特点,通过直接控制钛阳极和不锈钢阴极之间的电流,可以快速实现高效率和快速转移。
  • 该转移系统无缝地结合了传统的转移技术,允许最快和最有效的蛋白质从凝胶转移到膜。

电聚焦电泳系统BT105(生产商:G BIOSCIENCES)

特性

  • 消除凝胶泄漏问题;不需要录制。
  • 有两种梳子可用于小井和大井。
  • 提供一个可选择的电源。
  • 使用方便,重量轻。

DNA电泳系统EPS-2014(制造商:INOVIALAB)

特性

  • EPS-2014迷你电泳系统是一个紧凑,聪明的设计,专门为DNA和RNA电泳。
  • 由于有磁性传感器,电流只能在盖子打开时流向电极。
  • 当系统运行时,将盖子取下或打开时,电流立即被切断。

等电聚焦电泳系统SymphonyIEF(制造商:Hercuvan)

特性

  • 一种名为SymphonyIEF等电聚焦的多功能机器可以处理大多数IEF需求,从小规模到高通量操作。
  • 当电极框直接连接到冷却板上时,它与IEF和PAGE水平预制凝胶一起工作。

参考文献

  1. 魏万纳坦,Unlü, M.,明登,J. S.(2006)。二维差分凝胶电泳。自然学报,1(3),1351-1358。https://doi.org/10.1038/nprot.2006.234
  2. Buyukkoroğlu, G。,多拉,D . D。奥兹德米尔,F。,H &ızel, c(2018)。蛋白质分析技术。组学技术与生物工程,317-351。doi: 10.1016 / b978 - 0 - 12 - 804659 - 3.00015 - 4所示
  3. https://javalab.org/en/dna-electrophoresis/
  4. https://conductscience.com/introduction-to-electrophoresis/
  5. https://study.com/learn/lesson/agarose-gel-electrophoresis-steps-purpose.html
  6. https://www.vedantu.com/biology/sds-page
  7. https://uomustansiriyah.edu.iq/media/lectures/6/6_2021_09_15!11_46_27_PM.docx
  8. https://sciencing.com/disadvantages-gel-electrophoresis-8003362.html
  9. https://www.medicalexpo.com/prod/hercuvan/product-113272-925705.html
  10. https://www.medicalexpo.com/prod/g-biosciences/product-301595-1013667.html
  11. https://www.medicalexpo.com/prod/inovialab/product-130336-1026357.html
  12. https://www.medicalexpo.com/prod/bioevopeak/product-301335-1060455.html

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