表的内容
- 生物分子是用不同的技术纯化的，根据它们的特定性质的差异，如大小，疏水性，生物识别，电荷等。
- 凝胶过滤是一种根据分子质量或大小的差异来分离成分的技术。
- 它是所有语言中最简单、最温和的色谱法技术和分离分子的基础上的差异大小。
的原则凝胶过滤色谱法
图片来源:MBL生命科学．
为了进行分离，将凝胶过滤介质装入柱中形成填充床。该介质是一种球形颗粒形式的多孔基质，选择这些颗粒是因为它们的化学和物理稳定性以及惰性(缺乏反应性和吸附性)。填充床用填充基质孔隙和颗粒之间空间的缓冲液进行平衡。孔内的液体有时被称为固定相，这种液体与颗粒外的液体处于平衡状态，称为流动相。
- 所使用的固定相是多孔聚合物基质，其孔隙完全被用作流动相的溶剂填充。
- 样品中的分子被泵入含有这种微孔填料(凝胶)的专门柱中。
- 分离的基础是一定大小以上的分子被完全排除在孔隙之外，而较小的分子部分或全部进入孔隙内部。
- 因此，流动相的流动将导致较大的分子不受阻碍地通过柱，而不穿透凝胶基质，而较小的分子将根据其穿透凝胶的能力而减慢。
凝胶过滤色谱的类型
组织分离
- 样本的组成部分根据大小范围分为两大类。
- 群分离可用于去除高分子量或低分子量污染物(如培养液中的酚红)或淡化和交换缓冲液。
生物分子的高分辨率分馏
- 样品的成分根据分子大小的不同而被分离。
- 高分辨率分馏可用于分离一个或多个成分，从聚合体中分离单体，确定分子量或进行分子量分布分析。
凝胶过滤色谱的步骤
- 将凝胶过滤介质的球形颗粒装入柱中。
- 将样本应用于列。
- 缓冲(移动相)和样品通过列移动。
- 分子在基质的孔隙中扩散进出(也被描述为样品在流动相和固定相之间的分配)。
- 较小的分子进入基质更深处，因此在柱上停留的时间更长。
- 当缓冲液连续通过色谱柱时，大于基质孔隙的分子无法扩散到孔隙中而通过色谱柱。
- 较小的分子扩散到孔隙中，并在通过柱的过程中被延迟。
- 分离发生在不同的时间间隔，随后是对成分的检测。
凝胶过滤色谱法的应用
- 凝胶过滤在酶、多糖、核酸、蛋白质和其他生物大分子的纯化中起着关键作用。
- 凝胶过滤也可用于促进变性蛋白质的再折叠通过仔细控制改变缓冲条件。
- 它用于蛋白质分馏实验。
- 凝胶过滤技术也用于分子量的测定。
- 根据糖、蛋白质、多肽、橡胶和其他物质的大小进行分离。
- 可用于测定纯化蛋白的四元结构。
凝胶过滤色谱法的优点
- 凝胶过滤是一种强大的技术，非常适合处理对pH值变化、金属离子或辅助因子浓度和恶劣环境条件敏感的生物分子。
- 凝胶过滤的一个显著优点是，条件可以改变，以适应样品的类型或进一步纯化、分析或储存的要求，而不改变分离。
- 分离可在有必要离子或辅助因子、洗涤剂、尿素、盐酸胍、高或低离子强度、37℃或根据实验要求在冷藏室中进行。
- 与离子交换或亲和层析不同，分子不与层析介质结合，因此缓冲液的组成不直接影响分辨率(峰间分离的程度)。
- 分析时间短。
- 定义良好的分离。
- 窄带，灵敏度好。
- 没有样品丢失。
- 所需的少量流动相。
- 流量可设置。
凝胶过滤色谱法的局限性
- 在短时间内可以解决的峰的数量有限。
- 在使用仪器之前必须进行过滤，以防止灰尘和其他微粒破坏柱和干扰探测器。
- 大多数链的分子质量都太接近了，以至于分离只能显示出宽阔的峰。
参考文献
- http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/GE_gelfiltration.pdf
- 威尔逊，K.，沃克，J.(2018)。生物化学与分子生物学原理与技术(8版)。剑桥大学出版社:纽约。
- https://www.slideshare.net/asabuwangwa/gel-permeation-chromatography-gpc
- http://www.materials-talks.com/blog/2016/08/30/an-introduction-to-gel-permeation-chromatography-in-30-minutes/
- https://chromatography.conferenceseries.com/events-list/applications-of-chromatography
- http://library.umac.mo/ebooks/b28050630.pdf
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5206469/