基因克隆 - 要求，原则，步骤，应用

通过
  • 生产特定基因的精确副本DNA使用基因工程技术的序列称为基因克隆。
  • 术语“基因克隆，”“DNA克隆，”“分子克隆，”和“重组DNA技术”一切都称为相同的技术。
  • 当从生物体中提取DNA时，获得其所有基因。在基因（DNA）中，克隆特定基因被复制形成“克隆”。
  • 克隆是一种用于分离和扩增感兴趣基因的方法。

DNA克隆可以通过两种不同的方法实现:

  1. 细胞DNA克隆
  2. 无细胞DNA克隆（PCR）

基因克隆(细胞)的要求

  1. DNA片段含有待克隆的所需基因。
  2. 限制性内切酶和连接酶．
  3. 向量-在宿主细胞中携带、维持和复制克隆基因。
  4. 宿主——重组DNA可以在其中复制。

基因克隆原理

含有被克隆基因的DNA片段被插入合适的载体中，以产生重组DNA分子。载体作为载体将基因转移到宿主细胞(通常是细菌)，尽管也可以使用其他类型的活细胞。载体在宿主细胞内繁殖，产生大量相同的副本，不仅是它自己的副本，而且是它所携带的基因的副本。当宿主细胞分裂时，重组DNA分子的副本传递给后代，进一步的载体复制发生。在大量细胞分裂后，产生一个相同的宿主细胞的菌落或克隆。克隆体中的每个细胞都含有重组DNA分子的一个或多个副本;这种重组分子携带的基因现在被认为是克隆的。

基因克隆的步骤

基因克隆的7个基本步骤是:

  1. 分离DNA [感兴趣的基因]待克隆的片段。
  2. 将分离的DNA插入合适的载体中形成重组DNA。
  3. 将重组DNA引入为称为宿主的合适生物体。
  4. 转化宿主细胞的选择和含有感兴趣基因的克隆的鉴定。
  5. 载体中引入的基因的乘法/表达。
  6. 分离基因表达的多个基因拷贝/蛋白。
  7. 纯化分离的基因拷贝/蛋白

基因克隆的步骤

A.分离DNA片段或基因

  • 要克隆的目标DNA或基因必须先被分离出来。感兴趣基因是基因的一个片段，它的产物(蛋白质、酶或激素)使我们感兴趣。例如，胰岛素的基因编码。
  • 可以通过使用限制性内切核酸酶（RE）酶来分离所需的基因，该酶在特异性识别核苷酸序列下切割DNA，称为朝向内部区域（因此内切核酸酶）产生钝或粘性端部的限制性位点。
  • 有时，逆转录酶也可用来利用mRNA合成所需基因的互补DNA链。

B.选择合适的克隆载体

  • 载体是一种载体分子，它可以携带感兴趣的基因(GI)进入宿主，在宿主中复制，并复制多个拷贝。
  • 克隆载体限于它们可以携带的插入件的尺寸。根据插入的尺寸和应用，选择合适的载体。
  • 不同类型的载体可用于克隆是质粒，噬菌体，细菌人工染色体（BAC），酵母人工染色体（yacs）和哺乳动物人工染色体（Mac）。
  • 然而，最常用的克隆载体包括所有其他可用载体旁边的质粒和噬菌体（噬菌体λ）。

C.克隆载体的基本特征

所有克隆载体都是载体DNA分子。这些载体分子通常应该有很少的共同特征，例如：

  • 它一定是在宿主细胞内进行自我复制。
  • 它必须拥有重新酶的独特限制性位点。
  • 供体DNA片段的引入不能干扰载体的复制特性。
  • 它必须具有一些标记基因，使得它可用于后来鉴定重组细胞（通常在宿主细胞中不存在的抗生素抗性基因）。
  • 它们应该容易地与宿主细胞分离。

D.重组DNA的形成

  • 质粒载体被用于分离供体DNA片段的相同的RE酶切开。
  • 供体DNA片段与质粒载体混合在一起。
  • 在DNA连接酶的存在下，发生碱基配对供体DNA片段和质粒载体。
  • 得到的DNA分子是两个DNA分子的杂交物 - GI和载体。在遗传学术语中，这种不同DNA链的混合称为重组。
  • 因此，这种新的杂合DNA分子也称为重组DNA分子，并且该技术被称为重组DNA技术．

E.重组载体转化到合适的宿主

  • 重组载体主要转化到合适的宿主细胞，即细菌细胞。
  • 这样做是出于以下一个或两个原因:
    • 复制重组DNA分子以获得GI的多个副本。
    • 使GI得以表达，从而产生所需的蛋白质产品。
  • 有些细菌是可以自然转化的;它们会自动吸收重组载体。

例如：芽孢杆菌，血红英，幽门螺杆菌，这是自然能干的。

  • 另一方面，其他一些细菌则需要通过人工方法，如Ca++离子处理、电穿孔等。

F.重组细胞的分离

  • 转化过程产生转化和非转化宿主细胞的混合群。
  • 选择过程只涉及过滤转化的宿主细胞。
  • 用于分离来自非重组细胞的重组细胞，采用质粒载体的标记基因。
  • 例如，PBR322质粒载体含有不同的标记基因(氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因)。使用pst1 RE可以敲除质粒中的氨苄青霉素抗性基因，使重组细胞对氨苄青霉素敏感。

G.选定宿主细胞的乘法

  • 一旦转化的宿主细胞通过筛选过程分开;必须为它们提供最佳参数来增长和繁殖。
  • 在这一步中，转化的宿主细胞被引入新鲜的培养基中。
  • 在此阶段，宿主细胞分裂并重新分割以及它们携带的重组DNA的复制。
  • 如果目的是获取许多GI副本，则允许简单地复制主机单元。但是为了获得兴趣的产品，必须提供有利的条件，使得载体中的GI表达了感兴趣的产品。

H.产品的分离和纯化

  • 下一步涉及将随附的载体或由其编码的蛋白质的繁殖Gi分离。
  • 接下来是分离的基因拷贝/蛋白的纯化。

基因克隆 - 要求，原则，步骤，应用

基因克隆的应用

  • 一个特定的基因可以被分离出来并确定其核苷酸序列
  • 可以鉴定DNA的控制序列和分析
  • 可以研究蛋白质/酶/ RNA功能
  • 可以识别突变，例如与特定疾病相关的基因缺陷。

参考资料

  1. http://www.biotechnologynotes.com/gene-cloning/7-main-steps-involved--gene-cloning/231
  2. http://www.unc.edu/depts/our/hmi/hhmi-ft_learning_modules/priceinsmodule/cloning/process.html.
  3. https://nptel.ac.in/courses/102103017/pdf/lecture%2035.pdf.
  4. https://www.kau.edu.sa/files/0012891/files/65467_gene%20cloning.pdf.
  5. https://www.tcd.ie/biology_teaching_centre/assets/pdf/by1101/jfby1101/jfby1101-lecture111101/jfby1101-lecture11v2-2013-bw.pdf.
  6. https://www.cheric.org/files/education/cyberlecture/e200402/e200402-301.pdf.
  7. https://eclass.upatras.gr/modules/document/file.php/bio276/gene%20cloning%20%26%20DNA%20Analysis.pdf.
  8. http://www.onlinebiologynotes.com/gene-cloning-steps-involved-gene-cloning/

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