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介绍
间接ELISA是一种两步的ELISA，其涉及两种抗体和标记的二抗的两个结合过程。将初生抗体与抗原一起温育，然后与二抗孵育。然而，由于二抗可能导致的交叉反应，这可能导致非特异性信号。在间接ELISA试验中，样品抗体夹在板上涂覆在板上的抗原和酶标记的抗物质球蛋白缀合物之间。添加酶底物质发色试剂会导致显色。这种颜色与结合样品抗体的量成正比。样品中存在的较多抗体，试验井的颜色发育越强。这种间接ELISA的这种形式适用于确定样品中的总抗体水平。
间接ELISA用于定量估计血清和其他体液中的抗体。在该方法中，将样本添加到涂有抗原的微量滴定板孔中，抗原被检测到抗原。经过一段时间孵育，洗涤孔。如果样品中存在抗体，则将形成抗原 - 抗体复合物，并不会被洗掉。另一方面，如果样品中不存在特异性抗体，则不会存在任何复杂的形成。然后，加入与酶缀合的抗异型抗体并孵育。在另一个洗涤步骤之后，加入用于酶的底物。
如果在初始步骤中存在复杂的形成，则二次抗同同型抗体将与初级抗体结合，并且在酶和底物之间存在显色反应。通过测量孔的光密度值，在加入静止溶液以阻止发色反应之后，可以确定在第一步中形成的抗原抗体复合物的量。
间接ELISA的步骤/过程
- 将微孔板与抗原一起孵育，用BSA洗涤并封闭。
- 加入并洗涤抗体样品。
- 加入酶联二抗并洗涤。
- 加入底物，抗体上的酶引发显色或荧光信号。
间接ELISA的优点
- 高灵敏度：每种抗原分子均有多于一个标记的抗体;
- 灵活：不同的主要检测抗体可与单个标记的二抗;
- 节省成本：需要较少的标记抗体。
间接ELISA协议
- 用抗原涂层微量滴定板：将50μl抗原溶液（涂料）分配到微量滴定板的孔中。
- 将涂膜板涂有塑料包装，以密封并孵育27小时0.c在孵化器中。
- 孵育后，揭示微量滴定板并将溶液丢弃到容器中。
- 洗涤步骤：通过用200μLPBS填充孔，去除涂布溶液并洗涤两次。通过移液除去溶液或洗涤。通过在纸巾上拍拍板来除去剩余的液滴。
- 阻止步骤：通过在室温下加入200μL阻断缓冲液来阻止涂覆的孔中的剩余蛋白质结合位点并在室温下孵育30分钟。
- 丢弃溶液并执行洗涤步骤。轻轻地将微孔板轻轻地将胶囊扔到纸巾上
- 使用微小纤维从小瓶到孔中加入50μl抗体溶液。
- 塑料包装中的包装板，并在室温下孵育2小时。用干燥吸收纸丢弃液体和拍板板。
- 重复洗涤步骤
- 重复阻塞步骤。
- 重复洗涤步骤。
- 向孔中加入50μL二次抗体试剂。
- 将微滴板用塑料包装包裹，并在室温下孵育2小时。
- 重复洗涤步骤。
- 将75μL底物溶液从小瓶中加入微滴板上的孔。
- 将微滴板以塑料包装包裹并在室温下孵育1小时。
- 将25μl停止溶液（0.5米NaOH）从小瓶中加入微滴板上的孔。
- 使用微量滴度读卡器测量NPP水解，请使用405nm过滤器。