植物线粒体的分离，酵母细胞，小鼠，细胞培养

通过
  • 线粒体是控制细胞生命和死亡的中间体细胞器。它们参与关键的代谢反应，合成大部分ATP并调节许多信号级联，包括细胞凋亡。
  • 研究从不同的组织和培养细胞中分离出的功能性线粒体，有助于全面了解线粒体的功能。
  • 线粒体可以从各种细胞或组织中分离出来。

植物(马铃薯块茎)线粒体的分离

植物(马铃薯块茎)线粒体的分离

材料和试剂

  • 曼尼尔
  • 3-morpholinopropane-1-sulfonic酸(拖把)
  • 氢氧化钾（KOH）
  • 牛血清白蛋白
  • 乙二胺四乙酸(EDTA)
  • 半胱氨酸
  • Percoll
  • 蔗糖
  • 二甲亚砜(DMSO)
  • 液态氮
  • 萃取介质
  • 清洗缓冲
  • 梯度缓冲区
  • Percoll梯度

设备

  • 马铃薯块茎
  • 6 x 250 ml预冷角转子
  • 8 x 50毫升预冷角转子
  • 榨汁机
  • 离心机(适用于50和250毫升试管)
  • 油漆刷(软)

过程

  1. Pre-cool离心机转子。
  2. 在提取缓冲液中加入半胱氨酸和牛血清白蛋白，调至pH 7.3。半胱氨酸是一种抗氧化剂，BSA结合脂肪酸和酚类物质，可以干扰线粒体功能，BSA还作为蛋白酶底物，帮助保护线粒体蛋白免受损害。
  3. 将土豆削皮，用榨汁机将去皮的土豆榨汁(1公斤榨汁大约500毫升)，然后将榨汁直接倒入1/2体积的榨汁介质中(这里是250毫升)。之后立即使用2m KOH调整pH为7.2，或者，对于更大的准备，在每公斤均质后。
  4. 将匀浆(总体积约750毫升)静置5分钟，让淀粉沉淀。
  5. 用漏斗过滤两层棉花(或类似的)，然后转移到离心管。
  6. 将~ 190ml滤液转移到四个250ml离心管中。平衡管，并在3000 x g离心5分钟在一个6 x 250 ml预冷角转子。
  7. 小心地将上清倒入新鲜的离心管中(避免转移颗粒)，平衡并在18000 x g离心10分钟。
  8. 轻轻丢弃上清液而不干扰粒料，并使用涂料刷将每个颗粒重悬于1ml 1x甘露醇梯度缓冲液中。重悬的颗粒总量8-10ml。
  9. 使用塑料巴斯德吸管准备两个Percoll阶梯梯度。避免混合的带子，首先轻轻地分层50%，然后28%，最后20% Percoll(所有在甘露醇)在50毫升离心管彼此之上。
  10. 在两个Percoll阶梯梯度上轻轻分层粗馏分(每个梯度最大4-5 ml)。
  11. 平衡管和离心机在40000 x g使用一个8 x 50 ml预冷角转子30分钟。
  12. 使用巴斯特移液管将线粒体带从每个管中转移到新的50ml管中，用洗涤缓冲液填充至多40ml并混合。
  13. 将两管相互平衡，18000 x g离心10分钟。
  14. 小心去除上清液，用洗涤缓冲液重悬了非常松散的颗粒，用洗涤缓冲液填充40毫升并混合。
  15. 在18000 x g的压力下平衡并离心10分钟。
  16. 去除上清液，用油漆刷将非常松散的颗粒重新悬浮在1ml 1x甘露醇缓冲液中，轻轻地覆盖在两个28% Percoll蔗糖梯度上。
  17. 平衡和离心机在40000 x g使用8 x 50毫升转子30分钟。
  18. 将线粒体带转移到两个新鲜的50ml离心管中，加入40ml洗涤液并混合。
  19. 以18,000 x g离心10分钟。
  20. 小心地去除颗粒的上清液并重复洗涤（作为步骤13-14）。
  21. 去除上清液，将每个颗粒重悬于500µl洗涤液中。添加5% (v/v) DMSO用于完整细胞器的冷冻。
  22. 在液氮中捕获冻结并储存100-200μL的等分试样。通过这种方式，如果在使用前很快迅速解冻，线粒体将保持其闭力和呼吸功能。

预期结果

每个颗粒的最终体积约为800µl，含有4-6 mg(总8-12 mg)线粒体蛋白。

微生物(酵母细胞)线粒体的分离

所需的材料

  • 酵母文化
  • 冷冻离心机
  • 15毫升离心管
  • 氯化钠(0.9%)
  • 微量吸液管
  • 冰冷裂解缓冲液
  • 瓶
  • 线粒体存储缓冲区
  • 冰箱
  • 15毫升微型离心管

过程

  1. 无菌转移过夜酵母培养物到两根15ml离心管中。
  2. 在4°C下将其达到500克10分钟。
  3. 小心地除去上清液而不会扰乱颗粒。
  4. 用微管用1ml氯化钠(0.9%)仔细冲洗颗粒。
  5. 使用微肺料丢弃来自离心管的氯化钠。
  6. 将颗粒重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中并使用微肺衬电池混合井。
  7. 在摇床上4°C孵育10分钟。
  8. 1000g, 4℃离心10分钟，小心取出上清。
  9. 将细胞颗粒重悬在1.5 ml冰冷破坏缓冲液中，用钝头针完全破坏细胞。
  10. 1000g的裂解液在4℃下离心10分钟。
  11. 将上清转移到一个15mL的新鲜试管中，并混合从步骤7中获得的上清。
  12. 6000g 4℃离心10分钟，弃上清。
  13. 用线粒体储存缓冲液洗涤颗粒。
  14. 6000g 4°C离心20分钟。
  15. 在线粒体储存缓冲液中重新悬挂颗粒，并在-20°C下储存。

从肝组织中分离线粒体（小鼠）

材料和试剂

  1. 常规均化器和杵（A和B）
  2. 小剪刀
  3. 镊子
  • 离心管
  • 老鼠
  • 盐钾
  • 钠盐
  • 蔗糖
  • 牛血清白蛋白
  • 乙二胺四乙酸二水二钠(EDTA)
  • 乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）
  • 二硫苏糖醇(DTT)
  • HEPES.
  • 蛋白酶抑制剂(100倍)
  • D-甘露醇
  • 氯化镁六水合物（MgCl2）
  • 氢氧化钾（KOH）
  • 氢氧化钠（NaOH）
  • 提取缓冲器

过程

  1. 通过颈椎脱位牺牲鼠标，立即取出肝脏并将其放入冰冷的烧杯中，用萃取缓冲液。
  2. 通过添加和除去冷新鲜提取缓冲液冲洗肝脏，直至大部分血液被移除（5-6次洗涤）。
  3. 将肝脏放入烧杯中，用小剪刀切成均匀状。
  4. 将切碎的肝脏转移到Dounce均质器中，加入大约3毫升冷提取缓冲液。
  5. 随着均化器放入冰容器中，用杵（松动器）轻轻地将组织磨损10次，另一个杵（更紧密）。避免形成气泡至关重要，以获得高质量的线粒体。
  6. 将匀浆转移到离心管中，用新鲜的冷提取缓冲液完成30-40毫升。遵循微分离心步骤。
  7. 将10分钟以700 xg和4°C离心10分钟。将上清液倒入新的冰冷管，并丢弃含有核和完整细胞的颗粒。
  8. 在4℃下再次以700×g再次离心操作，然后在4℃下再次离心10分钟并随后将上清液倒入新的冰冷管中。
  9. 10000 x g离心15分钟，4°C。弃掉上清液，将颗粒重新悬浮在冰冷的提取缓冲液中。
  10. 在4°C下，10,000 x g离心15分钟，丢弃上清，在最小体积(约0.3 ml)的提取缓冲液或特定的实验缓冲液中重新悬浮最终的颗粒。
  11. 分离后，用标准方法测定蛋白浓度。

预期结果

通常，从一个肝脏获得约30-40mg线粒体蛋白质。

从骨骼肌中分离线粒体（鼠标）

试剂

  • 肌线粒体分离缓冲液1 (IBm1):将6.7 ml 1 M蔗糖、5 ml 1 M Tris/HCl、5 ml 1 M KCl、1 ml 1 M EDTA和2 ml 10% BSA混合，制备100 ml IBm1。调整pH值至7.4。加入蒸馏水至100毫升。
  • 缓冲2用于肌肉线粒体分离（IBM2）:将25ml 1 M蔗糖，3ml 0.1 M EGTA/Tris和1ml 1 M Tris/HCl混合，制备100ml IBm12。调整pH值至7.4。加入蒸馏水至100毫升。

过程

  1. 通过颈椎脱位杀死小鼠。使用手术刀，迅速取出感兴趣的骨骼肌，并将其浸泡在一个小烧杯中，该烧杯含有5毫升冰水磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并添加了10 mM EDTA。
  2. 用剪刀将肌肉切成小块，修剪可见的脂肪、韧带和结缔组织。
  3. 用补充有10mM EDTA的冰冷的PBS洗涤切碎的肌肉两次或三次。
  4. 将5毫升冰冷PBS中的碎肌重悬于补充有10mM EDTA和0.05％胰蛋白酶30分钟的5ml冰冷的PBS中。
  5. 200g离心5分钟，弃上清。
  6. 重新悬浮在IBM1中的颗粒。
  7. 使用特氟隆研磨棒以每小时1600转的速度均匀化肌肉;抚摸剁碎的肌肉十次。
  8. 将匀浆转移到50ml聚丙烯Falcon管中，并在4°C下700g离心10分钟。
  9. 将上清转移到玻璃离心管中，8 000g, 4℃离心10分钟。
  10. 丢弃上清液并将颗粒重悬于5ml冰冷的IBM2中。
  11. 8000 g 4°C离心10分钟。
  12. 倒出上清，重悬含线粒体的颗粒。你可以用玻璃棒来松开小球糊。避免加入IB，并尝试在丢弃上清后残留的少量缓冲液中重新悬浮线粒体。使用200ml移液器，避免在再悬浮过程中产生气泡。
  13. 将线粒体悬浮液转移到14毫升管中并将其保持在冰上。
  14. 使用伯脲方法测量线粒体浓度。

细胞培养中线粒体的分离

细胞培养中线粒体的分离

所需试剂

  • 1升冷SE与以下成分：
    • 250 mm蔗糖= 85.58g / l
    • 5 mM Tris = 0.606 g/l
    • 2 mM EGTA = 0.76 g/l
    • 使用4˚C毫克水，pH至7.4使用2米HCl，保持冰

过程

  1. 将细胞生长至3×500cm2组织培养板中的85-95％汇合
  2. 关于生长，从所有媒体上吹走。
  3. 用30毫升冷STE洗涤细胞单层，吹掉所有练标
  4. 用30毫升冷STE和吸气洗涤第二次
  5. 使用清洁的剃刀刀片从板表面刮下细胞单层
  6. 在5ml冷STE中重新悬浮刮片细胞，转移到离心管(50ml)。重复两次。
  7. 对所有组织培养板重复步骤2-6，将细胞汇集到离心管中(每个托盘1管)。
  8. 在4℃2000rpm下旋转细胞10分钟。
  9. 小心地吸出上清液（颗粒稍微漫射）并保留细胞沉淀。
  10. 将细胞微球重悬在3.5 ml冷STE中，其中含有蛋白酶抑制剂和0.5%无脂肪酸BSA，转移到7ml冷玻璃-特氟隆均质器中。用1.5 ml含0.5%无脂肪酸牛血清白蛋白的STE清洗试管并转移到匀浆器中。
  11. 10次缓慢通过“紧密”柱塞均质细胞和转移匀浆到一个50毫升离心管。如有需要，可加冰STE。
  12. 在4˚C（1管）以3000rpm旋转3000rpm的匀浆3分钟
  13. 将上清液通过双层湿棉布过滤，并在4˚C下以10000 rpm旋转11分钟(2管)
  14. 倒出上清液并擦拭管内壁。
  15. 将线粒体颗粒重新悬浮在冰冷的STE中，并转移到15ml离心管中。加满冰STE，以11,600 G旋转10分钟。
  16. 用冷试管作为杵将线粒体颗粒重新悬浮在残留的上清液中。
  17. 保持线粒体在冰上。

预期结果

预期收益率从3 x 500厘米2在400-600μl中，85％的细胞汇集板是约15-25mg线粒体蛋白质。

参考

  1. https://bio-protocol.org/e1809.
  2. Frezza，C.，Cipolat，S.和Scorrano，L.（2007）。细胞器分离：来自小鼠肝，肌肉和培养的成纤维细胞的功能性线粒体。NAT PROTOC 2（2）：287-295。
  3. Amigo，I.，Traba，J.和Rueda，C. B.（2016）。通过差动离心分离肝线粒体。生物协议6（10）：E1809。
  4. Rueda, C. B.， Traba, J.， Amigo, I.， Llorente-Folch, I.， Gonzalez-Sanchez, P.， Pardo, B.， Esteban, J. A.， del Arco, A.和Satrustegui, J.(2015)。线粒体ATP- mg /Pi载体SCaMC-3/Slc25a23可抵消由兴奋毒性损伤引起的parp -1依赖性线粒体ATP下降。J神经科学35(8):3566-3581。
  5. https://www.researchgate.net/profile/Irina_Perevoshchikova/post/How_can_I_isolate_mitochondria_from_cells/attachment/59d6280ec49f478072e9b900/AS%3A272429455216661%401441963651869/download/B2+mito+isolation+2+%281%29.docx
  6. https://www.nature.com/articles/nprot.2006.478
  7. https://idp.nature.com/authorize?response_type=cookie& client_id=grover＆redirect_uri=https%3a%2f%2fwww.nature.com%2farticles%2fnprot.2006.478
  8. http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=187&sim=327&cnt=2
  9. https://bio-protocol.org/e1226.

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