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什么是病毒的负染色?
染色技术的目的是在显微镜下显示对比。病毒染色是为了增加病毒和背景之间的对比。an的使用电子显微镜增强了向着色剂方向的电子密度。阴性染色是研究病毒、细菌形态的最优秀技术之一。病毒的阴性染色会使背景染色,使病毒不被染色物覆盖或接触不到。这意味着病毒颗粒周围的染色可见,确定了其结构,它还可以穿透病毒周围描述其生理的小突起。病毒周围任何接触到染色剂的损伤都可以被发现,它可能会暴露出病毒颗粒的内部结构。
- 用支撑膜作为标本托,用重金属染色进行负染色。
- 支持膜可以是塑料薄膜或碳薄膜;塑料薄膜随着时间变得疏水的,因此,需要经常清洗,而碳膜往往得到更好的结果是通过在高温下在真空下加热的碳蒸发到新鲜剥离云母(金属的金属片)的表面上。
- 在可视化过程中,染色剂中的重金属会遮蔽病毒。
- 在染色剂中发现的重金属元素是铂,因此在可视化过程中,涂有金属的区域散射电子并在照片中呈现出光,而未涂有金属的一侧和阴影区域则呈现出黑暗。
- 标本产生的外观就像一束光照射在它上面产生了阴影。
病毒阴性染色的目的
为了可视化,并识别在电子显微镜下的病毒生理特征
病毒的阴性染色原理
- 病毒负染色涉及使用其中样本或样品被放置在支撑膜的。
- 使用碳支持膜,加入小浓度的样本,如病毒样本的小浓度0.05和0.1 mg ml- 1对于完整的病毒颗粒,如腺病毒和流感病毒,浓度为1毫克毫升- 1应该使用。
- 然后用重金属盐浸泡样品,让其风干,使样品分子周围的染色剂干燥。
- 试件被包含在支撑膜(试件支架)上。
- 最优选的支撑膜是碳膜,其效果优于塑料膜。
- 碳膜的外表面是疏水的,但它的界面是干净的亲水的。
- 样品被吸在碳膜和云母层之间。
- 当样品被碳膜吸收后,将碳膜悬浮在负染池中,负染池可以是醋酸铀酰或钼酸铵或硅钨酸钠。
- 一个铜网格被放置在染色浮碳膜的顶部。
- 可以通过在网格上放置小纸片来挑选网格,当纸变湿时,它被举起来,沿着缎子水池带走网格和碳膜。
- 碳膜从铜网格的边缘伸出来,形成了带有污渍的碳层,因此形成了纸网格-碳样本三明治。
- 然后将该夹心复合物放置在滤纸上,以允许下的电子显微镜可视化之前印迹和在空气中干燥
- 使用电子显微镜可以获得样品的彩色图像的最大分辨率,最好使用透射电子显微镜在可视化病毒及其组件时使用。
- 分子会显得很亮,而有空间的区域会显得较暗,即对电子不透明。
- 在透射电子显微镜下观察的样品必须经过特别的准备,以便通过固定、脱水、切片和染色来观察和创建样品的高质量图像。
- 这就产生了样品的强烈彩色图像。
用于染色和可视化病毒样品的下透射显微镜制备
通过使用电子显微镜,样品必须用铀或钨的重金属盐浸渍。每一种金属都是在不同pH值的复合复合物中制备的,也取决于要染色的病毒类型。
- 铀酰乙酸其中含有铀的pH值很低,只有4.4。它通常用来染色包膜病毒,通过将ios铀酰与带负电荷的脂质包膜头结合来稳定病毒膜。它对病毒颗粒的上部进行染色,而对支持膜不进行紧密染色。它产生支持膜表面的叠加图像和病毒粒子反面的图像。不利的是,已知乙酸铀酰可与核酸、蛋白质和脂类反应,这可能导致阳性染色结果而不是阴性染色结果,而且它可能具有放射性。
- 钠silicotungstate (SST)它含有钨和硅钨酸。酸溶于水,用氢氧化钠中和,用乙醇沉淀(冷),形成中性pH值,是化学惰性染色剂。它与支撑膜紧密结合,概述了与膜结合的病毒的形态和生理特征,包括病毒蛋白质。然而,染色产生大的染色分子,这可能难以可视化,限制了图像分辨率。它是显示小病毒蛋白的一种有用的染色剂。
- 钼酸铵在中性pH值的情况下,干燥后能牢固地附着在支撑膜上。因此,它已被用于可视化大的病毒颗粒,如正粘病毒。与显微镜下的其他染色剂相比,它具有较高的对比度,但它只能显示或可视化粒子的外部部分,这有利于阴性染色。
病毒阴性染色程序
所需材料和试剂
- EM网格级镊子(2对或2对以上)
- 铀酰乙酸
- 超纯净水(如:milliq水)
- 培养皿中
- 4x 2ml带螺旋帽的微离心机管
- 4毫升塑料培养管,带盖
- 小搅拌棒
- 搅拌盘
- 滤纸(切成挖起杆)
- 0.02µm注射器过滤器和注射器(3- 5ml)
- 实验服,呼吸保护(口罩),眼睛保护
- 计时器
- 醋酸铀酰的废物容器
醋酸尿酯的制备
- 0.04 g醋酸铀酰+ 2ml超纯净水= 2%醋酸铀酰
用醋酸铀网格上的病毒议事负染
- 用超纯净水在4ml的试管中准备2ml的2%醋酸尿酯,并搅拌,使样品混合约30分钟至1小时。
- 使用0.02µm注射器过滤器过滤醋酸尿酯溶液,进入2ml螺旋帽管,以去除不溶解的醋酸尿酯颗粒。
- 用电子显微镜的网格级镊子夹住网格。
- 用移液管滴三滴醋酸铀酰到网格光亮的一侧,让它把废液流到废液容器中。
- 添加乙酸双氧铀的光泽面侧的另一液滴并允许它静置45秒。
- 采取一滤纸上并用超纯水弄湿其楔。
- 用滤纸的湿楔,将污渍从网格上带走,在网格上留下一层薄薄的光泽。
- 对干燥的培养皿网格设置的镊子,从任何物体挡住,并使其保持干燥约1小时。
- 电镜观察。
谨慎:
- 乙酸双氧铀是有毒的,从而,用一个实验室外套,保护眼睛,呼吸面罩,和粉末形式的处理,当它手套;
- 网格上留下了太多的污渍,你在TEM中看到的都是污渍;
- 太少污点留在电网和你的病毒不会被染色阴性。
结果和解释
- 不同病毒的电子显微照片揭示了病毒的不同特征。
- 例如,腺病毒显示长纤维伸出约120-350kDa和约300kDa的戊基。
- 正粘病毒揭示与它们的形态沿着表面的尖刺。
- 轮状病毒根据采集样本的不同,显示大量致密的病毒颗粒。
病毒阴性染色的优点
- 它很容易执行。
- 这是一种快速的技术。
- 它不需要特殊的设备来执行。
- 负染色报价为小病毒蛋白的可视化的快速平台,并帮助确定其寡聚状态。
病毒阴性染色的局限性
- 在风干过程中,易碎的标本,如包膜病毒,可能会压扁并挤出脂泡。
- 在吸附过程中,所涉及的分子力可引起构象变化,包括病毒的生理收缩,脂质可能变得僵硬/致密,使可视化变得困难。
负染色中的应用
- 研究病毒的形态学、生理学,如表面抗原、尖刺、细丝等。
- 为了研究细菌的形态,如鞭毛和纤毛片段。
引用和来源
- 普雷斯科特的微生物学,第五版
- https://www.intechopen.com/books/microbiology-in-agriculture-and-human-health/negative-and-positive-staining-in-transmission-electron-microscopy-for-virus-diagnosis
- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128012383025630
- https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-59745-294-6_7
- http://web.path.ox.ac.uk/~bioimaging/bitm/instructions_and_information/em/neg_stain.pdf
- https://en.wikipedia.org/wiki/Negative_stain
- https://cpb-us-west-2-juc1ugur1qwqqqo4.stackpathdns.com/u.osu.edu/dist/e/20087/files/2015/08/Positive_and_Negative_Stainging_of_Viruses_on_TEM_Grids-239c21p.pdf