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茚三酮测试定义
茚三酮试验是化学测试以检测氨，伯/仲胺的存在下，或氨基酸。该测试涉及加入茚三酮试剂的测试样品的结果在深蓝色的形成，常常称为Ruhemann的紫色，在氨基的存在。
茚三酮测试目标
- 为了检测胺存在和氨基在测试溶液中。
- 为了定量的酸存在于样品中的氨基。
- 从氨基酸区分碳水化合物。
茚三酮测试的原理
- 该测定是基于以下事实：茚三酮的两个分子（2，2- dihydroxyindane-1，-1,3-二酮）具有游离的α-氨基酸，以产生深紫色或蓝色的颜色称为Ruhemann的紫色反应。
- 在该反应中，茚三酮作为氧化剂，并导致在升高的温度下的脱氨基和氨基酸脱羧。
- 然后，该反应之后是茚三酮的第二分子释放的氨还原茚三酮分子之间的缩合，和。
- 由反应结束时，一个复杂的diketohydrin形成具有深紫色。
- 在像脯氨酸和羟脯氨酸氨基酸，该测试产生一个亚胺盐，其为黄色 - 橙色。
- 同样，与像天冬酰胺游离amind组蛋白质，与茚三酮试剂反应以形成棕色产物。
- 所形成的复合物的强度正比于溶液中的氨基酸的浓度。
- 颜色强度，反过来，取决于氨基酸存在的类型。
反应
图像来源：Biocheminfo。
要求
试剂
- 茚三酮试剂：茚三酮溶解在100ml乙醇中的0.35克（异丙醇或1：丙酮的1:1混合物/丁醇可以用于代替乙醇）。
- 稀释溶剂（用于定量试验）：混合等于水和正丙醇的卷。
- 标准溶液（1％蛋白质溶液）
- 样品溶液
需要材料
- 试管
- 试管架
- 吸管
设备
- 水浴
- 分光光度计
茚三酮测试的程序
对于定性分析
- 采取在一个试管加入1ml的标准蛋白质溶液并且在另一干燥的试管将1ml试样。
- 加入茚三酮试剂几滴到试管两者。
- 放置在水浴中的试管5分钟，然后允许冷却到室温。
- 观察颜色的形成，并记下的结果。
对于定量分析
- 移液管出从提供股票溶液中的蛋白质溶液的不同体积（10微升，20微升，等等）成一系列试管的和补足体积至1mL蒸馏水。
- 取标记为一个含有只是蒸馏水1ml中和标记为2到9用于构建标准曲线的管的其余部分空白的管。管10-15是未知样本。
- 加入1ml的茚三酮试剂和5ml稀释溶剂的至每个管并通过涡旋混合均匀。
- 冷却管。
- 覆盖在顶部，并培育帽在90℃下17分钟或沸水浴中20分钟管。
- 冷却管至室温，并在570nm（对于脯氨酸和羟脯氨酸440纳米）对空白测量溶液的光密度。
- 制备吸光度的标准曲线对氨基酸浓度。
- 通过绘制的A570上的X轴氨基酸的Y轴和浓度的标准曲线确定未知样品中的氨基酸的量。
结果与茚三酮测试的解读
- 的紫色复合物在管中的存在表示正结果和表示氨基酸的样品中的存在。
- 由于没有在管中的复杂的表示否定的结果，并且指示缺乏样品中的氨基酸。
- 从图中，我们可以判断未知样品的浓度。
茚三酮测试的用途
- 茚三酮试验被用于检测未知样品中氨基酸的存在。
- 该试验也用于固相肽合成来监测蛋白质的氨基酸分析的保护。
- 由于茚三酮测试是相当敏感的，它通常用来检测指纹。这是可能，如肽和蛋白质的赖氨酸残基的末端胺脱落在指纹用茚三酮反应。
茚三酮测试的局限性
- 茚三酮起反应不仅反应用α-氨基而且还与在氨氮和其他游离胺。
- 作为位阻到达α氨基基团限制了水合茚三酮的水合茚三酮测试是不能有效地检测高分子量蛋白质。
参考资料和来源
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