Northern污染定义，原理，步骤，结果，应用

经过

北印迹D.efinition.

NORTHERN印迹是一种基于对复杂混合物中特定RNA分析的原理的技术。

  • 该技术是一个修改的版本南方斑点，已发现用于分析DNA序列。
  • 从不同类型的生物样品中提取的某些核酸的检测对于分子生物学是必不可少的，这使得在该领域的印迹技术是必需的。
  • 除了用于检测的探针之外，该原理与Southern印迹相同，因为作为Northern印迹检测RNA序列。
  • 该技术提供关于RNA序列的长度的信息以及序列中存在变化。
  • 即使该技术主要专注于RNA序列的鉴定，它也已被用于定量RNA序列。
  • 由于该技术的发现，已经在用于分析MRNA，前MRNA和短RNA的技术中进行了几种修改。
  • 使用Northern印迹作为分析RNA片段的主要技术长期;然而，像RT-PCR一样的新的，更方便和具有成本效益的技术已经缓慢更换了该技术。
北面印迹
北印迹。使用biorender.com创建

北方印迹原理

  • Northern印迹的原理与所有其他印迹技术相同，基于生物分子从一个膜转移到另一个膜。
  • RNA样品根据其尺寸在凝胶上分离凝胶电泳。由于RNA是单链的，因此可以通过分子间碱基配对形成二次结构。因此，在变性条件下进行RNA区段的电泳分离。
  • 然后将分离的RNA片段转移到尼龙膜中。硝酸纤维素膜不用作RNA不会有效地与膜结合。
  • 将转移的区段通过固定剂固定在膜上。通过加入与存在于膜上存在的RNA序列的标记探针来检测膜上的RNA片段。
  • 杂交形成RNA作为探针之间杂交特异性的基础，并且RNA允许精确识别这些段。
  • Northern印迹利用RNA段的大小依赖性分离，因此可用于确定转录物的尺寸。

要求

设备

  • 琼脂糖凝胶铸造
  • 电源
  • 微波
  • 离心机
  • 加热块
  • 紫外线交叉链接器
  • 杂交烤箱
  • 杂交血管
  • 小瓶
  • 钳子
  • 移液器
  • 玻璃管

材料

  • 琼脂糖凝胶
  • 柠檬酸钠
  • 乙二胺四乙酸二钠盐脱水
  • NaoH.
  • HCL.
  • 甲醛
  • 甘油
  • 溴化乙锭
  • 溴酚蓝
  • RNA梯子
  • Mgcl.2
  • NACL.
  • 聚乙烯吡咯烷酮
  • 牛血清白蛋白
  • SDS.
  • n2宝4.
  • TRIS-HCL
  • Triton-X.
  • DTT.
  • TAQ缓冲区
  • Taq聚合酶

北方印迹的程序/步骤

一种。RNA在变性凝胶上的分离

  • 通过向琼脂糖溶液中加入甲醛来制备RNA凝胶溶液。
  • 组装铸件，并将制备的变性凝胶倒入铸造中。当凝胶开始设定时，加入具有适当牙齿的梳子以形成孔。
  • 一旦凝胶被设定，梳子就被移除，并且在运行之前将凝胶与运行缓冲液平衡30分钟。
  • 将15μgRNA样品与等体积的RNA加载缓冲液混合。以相同体积的RNA负载缓冲液加入三个μgRNA标记物。
  • 将样品在65℃下在加热嵌段上温育约12-15分钟。
  • 将样品装载到平衡的凝胶中，并且第一行孔填充有RNA标记物。
  • 然后凝胶在125V下运行约3小时。

北方印迹的程序或步骤

图像来源：Ilewieszoośmiornicach（Wikimedia）。

湾将RNA从凝胶转移到尼龙膜中

  • 切割尼龙膜，其大于变性凝胶的尺寸，也制备了与尼龙膜相同尺寸的滤纸。
  • 一旦电泳过程完成，将从罐中除去RNA凝胶并用水冲洗。
  • 略大于凝胶的长圆形海绵放在玻璃盘子上，用SSC填充到一个点，以将浸泡的海绵留在缓冲液中。
  • 将3mm纸张的几件块放在海绵顶部，并用SSC缓冲液润湿。
  • 然后将凝胶置于滤纸上并通过在表面上滚动玻璃移液管挤出以除去气泡。
  • 制备的尼龙膜用蒸馏水润湿在不含rnase的盘上约5分钟。
  • 湿膜放置在凝胶的表面上，同时避免任何气泡形成。
  • 表面进一步淹没了SSC，还将一些过滤纸放在膜的顶部。
  • 将玻璃板放在结构的顶部，以使一切固定到位。该结构留在一夜之间以获得有效的转移。

C。固定化

  • 一旦转移完成，将凝胶除去并用SSC冲洗，并使其干燥。
  • 将膜放置在两片滤纸之间并在80℃下在真空烘箱中烘烤2小时。
  • 在一些情况下，膜可以用UV透明塑料包裹包裹并在UV过滤器上辐射适当的时间。

天。杂交

  • 使用的DNA或RNA探针将标记为> 10的特定活性8.DPM /μg和未掺入的核苷酸将被除去。
  • 携带固定的RNA的膜用SSC润湿。
  • 将膜置于具有RNA侧面的杂交管中，并加入1ml甲醛溶液。
  • 将管置于杂交烘箱中，并在42℃下温育3小时。
  • 如果使用的探针是双链，则通过在100℃下在水浴或培养箱中加热10分钟，使其变性。
  • 所需体积的探针是移液管进入杂交管，并在42℃下进一步温育。
  • 倒出溶液，用洗涤溶液洗涤膜。然后在放射自显影下观察膜。

结果解释Northern Blot

在带的形式下在射线照相下观察RNA带。条带与标记的距离可用于确定RNA片段的长度和半定量。

Northern印迹的应用

  1. 该技术可用于鉴定和分离来自不同生物来源的RNA片段。
  2. Northern印迹用作检测DNA片段转录的敏感性测试，其被用作南方印迹中的探针。
  3. 它还允许从不同组织和不同生物体的特异性mRNA检测和定量。
  4. Northern印迹用作与癌症引发基因过度抑制相关的基因表达研究的工具，以及移植物的引发基因的基因表达。
  5. Northern印迹被用作诊断瘢痕氏病等疾病的分子工具。
  6. 该方法用作检测病毒微大的方法，其在病毒感染中起重要作用。

北方印迹的局限性

  1. 与RT-PCR等现代技术相比，北印迹具有较低的敏感性和核酸酶保护测定。
  2. 该方法需要大量的样品RNA，这些方法应具有高质量。
  3. 该技术是耗时和复杂的，特别是在要添加多个探针的情况下。

参考

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来源

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