聚合酶链反应机器也被称为热循环器或DNA放大器，或热循环器。PCR机器用引物扩增从基因组中选择的DNA或RNA的小片段。这是一种便宜且非常有效的工具。
它在互补核酸杂交和核酸在数小时内以10^7倍的速度复制出特定的目标DNA/RNA序列。
PCR机用于研究实验室和临床诊断，用于复制DNA、检测DNA序列、进行DNA指纹、法医分析和分子克隆、诊断遗传疾病，并检测病原体，如乙肝和丙肝病毒、引起艾滋病的HIV-1病毒、沙眼衣原体，结核分枝杆菌，人类乳头状瘤病毒,并巨细胞病毒。这加快了其他对温度敏感的过程，如限制性内切酶消化或快速诊断。这些利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段。
PCR，有时被称为“分子复印”，经常被誉为分子生物学中最重要的科学发展之一。它彻底改变了DNA研究，它的发明者卡里·b·穆里斯(Kary B. Mullis)在1993年获得了诺贝尔化学奖。如果没有PCR扩增，分离的DNA片段的检测几乎是困难的，因为分子和遗传分析需要大量的DNA样本。
PCR原理
单链DNA模板被用作DNA聚合酶的支架，它指导从脱氧核苷酸底物合成DNA。当一个特别创造的寡核苷酸被退火到一个更长的模板DNA。DNA聚合酶将核苷酸添加到分子的3 '端。因此，DNA聚合酶可以利用合成的寡核苷酸作为引物，当退火到具有与寡核苷酸互补区域的单链模板时，延伸其3 '端，形成双链DNA的延伸段。
PCR仪的部件
- 热循环器有一个热块有孔可以插入装有反应混合物的管子。
- 它带有一个加热盖压在反应管盖上。盖子防止水从反应混合物凝结在盖子的内部。
- 顺时针旋转盖子旋钮会降低加热板，加热板对管盖加压，使其牢固地固定在阀块中，确保更好地接触。相反，在逆时针方向旋转时，盖子会弹出，这样用户就可以将盖子滑到后面。
- 控制面板包括一个大型图形显示器，方便阅读，显示各种系统特性和功能的当前状态，以及一个用于输入各种协议和设置的键盘。
- 的存在通风口在前面，侧侧和底侧便于出风和进风。
PCR组分(PCR试剂)
DNA模板
- 选择合适的PCR模板是至关重要的。
- RT-qPCR需要RNA模板来生成互补DNA，而传统PCR需要DNA模板。
- 因此，成功的PCR的第一阶段需要使用可靠的PCR模板制备试剂盒。
耐热DNA聚合酶
- 由于PCR的初始步骤需要在高温(90°C)下分离DNA链，所以所有的PCR反应都需要一种能够在高温(约70°C)下工作的DNA聚合酶。
- 一种流行的用于PCR的DNA聚合酶称为Taq聚合酶，从嗜热细菌中获得水生栖热菌是一种热稳定酶。
寡核苷酸引物
- 引物是核苷酸(DNA或RNA)的短链，是模板DNA的补充，是DNA/RNA聚合酶开始合成新DNA的起点。
- 引物是核苷酸(DNA或RNA)的短链，是模板DNA的补充，充当DNA/RNA聚合酶的DNA合成起始点。它们对DNA合成的开始是必要的。与在退火过程结束后产生氢键的变性相比，将引物退火到单链DNA需要更低的温度(50-65℃)。
三磷酸脱氧核苷酸(核苷酸)
- dNTPs是DNA聚合酶合成DNA所必需的．
缓冲系统
- 由于有聚合酶链反应缓冲液，聚合酶链反应总是保持最佳的条件。
- 三氯化氢、氯化钾(KCl)和氯化镁(MgCl)2)构成PCR缓冲液中的大部分成分。
- 为了在PCR过程中保持pH稳定，使用tris-HCl和KCl。为了保证DNA聚合酶在PCR过程中正常进行DNA合成，镁离子作为酶的辅因子。
PCR的步骤
变性
- 当反应混合物加热0.5 ~ 2分钟至94°C时，发生变性。
- 当DNA的两条链之间的氢键断裂时，单链DNA就产生了。
- 现在，单个DNA链作为合成其他DNA链的模板。
退火
- 大约20到40秒，反应温度降低到54到60°C。
- 在这种情况下，引物附着在模板DNA的互补序列上。
- 引物序列是20-30个碱基长，单链DNA或RNA片段。
- 它们在DNA的产生过程中扮演着前体的角色。
- 有两个引物——一个正向引物和一个反向引物——两条分离的链向相反的方向运行。
伸长
- 在这个阶段，温度会上升到72到80摄氏度之间。
- Taq聚合酶将碱基钉在引物的3 '端。结果，DNA从5 '延伸到3 '。
- Taq聚合酶可以承受极高的温度。结果产生了双链DNA分子。
为了在短时间内获得几个感兴趣的DNA序列，这三个步骤要进行20-40次。
PCR机操作规程
- 首先，用聚合酶链反应机加热样本，使DNA变性并分离成两段单链DNA。
- 随后，一种名为“Taq聚合酶”的酶用旧的DNA链作为模板，创建或构建两条新的DNA链。
- 由于这个过程，原始DNA被复制，每个新分子中都有一条旧的和一条新的DNA链。
- 在那之后，每条链都可以用来复制另外两个副本，以此类推。
- 当变性和创造新DNA的循环重复30或40次时，原始DNA片段的精确副本就会超过10亿个。
- 整个PCR循环过程是自动化的，可以在数小时内完成。该反应由一种称为热循环器的装置控制，该装置每隔几分钟就会改变反应的温度，以实现DNA的变性和合成。
PCR的种类
实时聚合酶链反应，也被称为定量PCR或qPCR，是一种利用荧光染料标记DNA分子，实时监测和量化PCR结果的技术。
逆转录酶(RT-PCR)在产生互补DNA (cDNA)的过程中将RNA转化为DNA。
嵌套PCR通过在最初的25-35个PCR周期内使用新的引物进行第二次PCR，降低了不希望出现的产物的可能性。
热启动PCR通过加热使用于灭活Taq聚合酶的抗体变性。
多重聚合酶链反应通过使用多个引物在单个DNA样本中复制多个片段。
远程PCR使用多种聚合酶，产生更大的DNA范围。
原位PCR是一种发生在细胞或载玻片上的固定组织中的PCR
目标DNA的一条链被一个不对称PCR的过程。
重叠引物的使用组装聚合酶链反应允许长DNA片段的扩增。
PCR应用程序
- 基因转录
- PCR可以研究不同细胞类型、组织和物种在特定时间内的基因转录差异。
- 逆转录是通过从感兴趣的样本中分离RNA来生成cDNA。
- 通过PCR产生的cDNA的数量可以用来计算特定基因的原始RNA水平。
- 基因分型
- 某些细胞或有机体的等位基因序列差异可以被确定。
- 转基因生物的基因分型有助于基因突变或转基因部分的扩增。
- 克隆和诱变
- PCR克隆通过将扩增的dsDNA片段插入到载体如gDNA、cDNA和质粒DNA中，可以培育出基因组成改变的细菌新菌株。
- 克隆有助于引入点突变使用位点定向突变本身采用重组PCR方法。
- 它还有助于创造新的基因融合。
- 测序伴随着模板DNA的扩增，它们的纯化，并通过测序步骤进行处理。
- 在文库准备阶段，PCR也被用于下一代测序(NGS)，对DNA样本进行量化，并用测序适配器标记它们，以便进行多路复用。
- 医学和生物医学研究
- 医学上的应用包括与疾病相关的基因变化，以确定传染性生物。产前基因检测利用PCR来检测怀孕期间的染色体异常和基因突变，为准父母提供关于他们的孩子可能患有某种特定遗传疾病的关键信息。
- 它还可以作为胚胎植入前的遗传诊断技术，用于筛选体外受精(IVF)胚胎。
- 法医科学
- 聚合酶链反应可用于鉴定样本来源和亲子鉴定的法医调查。
- 它被用于分子考古学，从文物中扩增DNA。
- 环境微生物学与食品安全
- 用PCR不仅可以在病人样本中发现病原体，还可以在食物和水等基质中发现病原体。这对诊断和预防传染病都很重要。
PCR的优势
- 允许更快，更明智的决策
- 菌血症的快速鉴别，特别是对细菌计数低的标本
- 有效识别肺外标本中涂片和/或培养可能遗漏的病例。
- 这对鉴别体外培养困难或需要很长时间培养的某些疾病很重要。产生结果的速度明显快于培养
- 它仍然被认为是一些依赖涂片和培养的诊断程序的辅助测试，如结核病。
- 它具有测试抗微生物药物耐药性的能力。
PCR的局限性
- PCR不可能进行未知目标扩增。引物的设计需要事先了解目标序列。
- 容易出错的DNA聚合酶有可能导致PCR产物突变。
- PCR非常容易受到污染。即使有少量受污染的DNA，检测结果也可能被误解或混淆。
- 随着扩增子大小的增加，PCR效率降低。
PCR仪使用注意事项
- 只应使用为PCR机设计的管和板。
- 在运行前，仔细检查管道，特别是板是否密封紧密。
- 溶液溢出应清理干净，生物危害容器应用于处理。
- 使用PCR机盖子时要小心。如果你把盖子掉到地上或摔坏了，这个可能会坏掉。
- PCR仪使用完毕后，应关闭。
- 在开始运行之前，确保PCR加热块是干净的。在开始之前，检查每个管座。
- 为了确保盖子平躺在管子的顶部，以便均匀加热和密封，将块茎均匀地分布在块上。
PCR机器示例
Biometra TAdvanced热循环器系列(Analytik Jena)
- 12个不同的样品块，包括一个96井的高端银块
- 随着今天强大的控制电子，甚至铝块可以产生更快的加热和冷却比通常可能的银块仪器。
- 最快的爬坡、最高的精度和智能块/井控(RAC)提供了最高的温度均匀性和再现性，编程目标温度无过调或过调。
- 快速加热，连续接触压力，和简单的使用都是高性能智能盖子技术(HPSL)的特点。
MiniAmp™Plus热循环器(ThermoFisher Scientific)
- VeriFlex块有三个不同的温度区，允许您精确地管理温度为您的PCR优化。
- 一个5英寸直观的彩色触摸屏，编程和指导新用户的紧凑尺寸-只有19厘米宽，39厘米深的占地面积，MiniAmp热循环器可以容纳几乎任何地方。Thermo Fisher Connect的WiFi功能使您可以从任何移动设备或台式电脑上设计并安全地上传您的方法。
- 此外，因为它的气流是前后的，你可以把多个单元并排放置，以节省宝贵的工作台空间。
PCR热循环器(Esco)
- 对于所有类型的PCR过程，包括梯度PCR，触式PCR，高通量PCR，原位PCR，以及其他使用一系列PCR管，条，板和载片的PCR，
- Esco提供了传统的热循环器和实时热循环器模型的选择，以满足严格的要求。
- 为了建立和保持精确的控制和快速的斜坡速率，在过程速度和精度方面，几乎没有超调或过调，Swift热循环器使用尖端的Peltier温度控制技术。
GET-S系列热循环器(生物发生器)
- GET-S系列热循环器采用了延长使用寿命的peltier。其最大爬坡速率为4.5°C/s，循环次数超过100万次。
- 该产品集成了许多前沿技术，包括Android操作系统，彩色电容触摸屏，许多块可能性，集成WIFI模块，PC软件控制功能，电子邮件通知功能，大存储容量，等等。
- 这些特点使PCR具有良好的性能，可以满足更高的实验要求。
MiniAmp Plus热循环器和MiniAmp热循环器(Delta Science)
- 适合任何台式电脑，因为它的体积小。
- 使用Thermo Fisher Connect，您可以从任何可以访问互联网的位置轻松访问您的仪器。
- 当您升级到应用生物系统MiniAmpTM Plus热循环器时，您可以选择VeriFlexTM温度控制技术进行PCR优化。
参考文献
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