- 聚合酶链反应是一种酶的过程，在这个过程中，DNA的特定区域被反复复制，从而产生特定序列的许多副本。
- 目前应用最广泛的核酸靶扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)。
- 这种方法结合了互补核酸杂交的原理和经过多次循环重复应用的核酸复制的原理。
- 这种方法能够放大单个副本核酸目标，通常无法检测到标准杂交方法，并增加到107或者在相对短的时间内复制更多的副本。
- 这就提供了大量的目标，可以用多种方法轻易地检测到。
表的内容
聚合酶链反应原理
将核酸的目标序列变性为单链，添加针对每个目标链序列的引物，并DNA聚合酶催化脱氧核苷酸的加入延伸并产生与每个目标序列链互补的新链(循环1)。在循环2中，循环1的两个双链产物变性，随后被DNA聚合酶作为更多引物退火和延伸的靶点。25到30次循环后，至少10次7通过这种热循环可以产生目标DNA的副本。
聚合酶链反应的要求
- PCR反应包含目标双链DNA，两个与目标相反链的侧翼序列杂交的引物，所有四个脱氧核糖核酸苷三磷酸和一个DNA聚合酶以及缓冲和辅助因子酶和水。
- 由于反应周期性地加热到高温，聚合酶链反应依赖于使用热稳定的DNA聚合酶。
- 许多这种来自嗜热细菌(生活在高温环境中的细菌)的热稳定性酶现在可以在商业上买到。
- 第一种也是最常用的是来自嗜热细菌的Taq聚合酶水生栖热菌．
步骤
A.目标核酸的提取和变性
- 对于PCR，首先从生物或可能含有目标生物的临床样本中通过加热、化学或酶的方法提取(释放)核酸。
- 一旦提取出来，目标核酸被添加到包含PCR所有必需组分(引物、核苷酸、共价离子、缓冲液和酶)的反应混合物中，并放入热循环器中进行扩增。
B.放大步骤
- 传统PCR包括25至50个重复循环，每个循环包括三个连续反应:
- 变性靶核酸的
- 引物退火以单链靶核酸为引物扩增靶双工。
- 扩展引物-目标双工的。
变性
- 反应混合物加热到95°C短时间内(约15-30秒)使目标DNA变性为单链，可作为DNA合成的模板。
引物退火
- 混合物被迅速冷却到指定的温度，使两个引物能够与目标DNA侧翼的两条链上的序列结合。
- 引物是核酸的短单链序列(即寡核苷酸，通常有20到30个核苷酸长)，被选中与特定的核酸靶特异杂交(退火)，本质上像探针一样工作。
- 这个退火温度是经过仔细计算的，以确保引物只与所需的DNA序列结合(通常在55oC)。
- 每个链上都有一个引物。两个亲本链不会彼此重新退火，因为引物在亲本DNA上的数量大大超出。
扩展
- 混合物的温度被提高到72°C(通常)，并在这个温度下保持预先设定的一段时间，以允许DNA聚合酶通过复制单链模板拉长每个引物。
- 将引物退火到目标序列提供了必要的模板格式，允许DNA聚合酶在每个引物的3 '端(端)添加核苷酸，并扩展与目标模板互补的序列
- Taq聚合酶通常用于引物延伸，发生在72°C。使用这种酶是因为它能够在高温下高效工作，并通过几个循环承受94°C的变性温度。
- 允许引物退火和延伸在高温下进行而不损害聚合酶的能力增加了反应的严格性，从而减少了非目标核酸的扩增机会(即非特异性扩增)。
重复PCR循环的三个步骤。
- 因此，在第二个循环中，四条链变性，结合引物并被延伸。不需要添加其他反应物。这三个步骤在第三个循环中重复，以此类推，在一组额外的循环中重复。
- 到第三个循环时，一些PCR产物只代表两个引物位点之间的DNA序列，序列不会延伸到这些位点以外。
- 随着反应循环次数的增加，双链DNA的合成也越来越多。经过20次循环后，原始DNA被放大了一百万倍，30次循环后，这个数字上升到十亿倍(1000亿)。
c .产品分析
- 扩增后的产物通常采用凝胶电泳。
- 利用琼脂糖凝胶电泳对扩增的DNA进行分子大小的电泳迁移。
- 放大的DNA形成清晰的条带，在紫外线下可以观察到。
PCR的优点
- PCR(聚合酶链式反应)是一种非常简单但却非常强大的技术。
- 它允许对任何特定的DNA序列进行巨大的扩增，前提是已知其两侧的短序列。
- 允许更快的诊断和识别，同时提高敏感性和保持特异性。
应用聚合酶链反应
聚合酶链反应已经有了非常广泛的应用，新的用途也在不断地被设计出来。
- PCR可以从复杂的混合物中扩增单个DNA分子，在很大程度上避免了用DNA克隆来制备该分子的需要。该技术的变体同样可以从复杂的混合物中扩增出特定的单个RNA分子。
- 利用聚合酶链反应(PCR)已经大大简化了DNA测序，而且这种应用现在很普遍。
- 通过使用合适的引物，可以利用PCR对目标DNA进行点突变、缺失和插入，极大地方便了基因表达和功能的分析。
- 聚合酶链反应非常灵敏，可以扩增少量的DNA。因此，使用适当的引物，可以在组织中检测到非常少量的特定细菌和病毒，使PCR对医学诊断无价。
- 聚合酶链反应(PCR)现在在鉴定具有重要医学意义的DNA样本方面是无价的。例如，在筛查人类遗传疾病方面，它正在迅速取代限制性片段限制性蛋白的使用。
- 由于其极高的灵敏度，PCR现在对法医学具有根本性的重要性。甚至可以使用PCR来扩增犯罪现场留下的一根头发或一滴血的DNA，以便进行详细的描述。
参考文献
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