叶绿体分离的协议

  • 叶绿体是在植物细胞中进行光合作用的重要细胞素。
  • 它由一对紧密间隔的膜,双膜封闭封闭,由界定基质或基质的内膜和与细胞质接触的外膜组成。
  • 叶绿体是用于研究氯塑料过程的最佳原料,例如碳同化,电子流量和磷酸化,代谢转运或蛋白质靶向。
  • 可以进一步提取叶绿体馏分以获得膜,基质或囊体蛋白以及叶状蛋白和RNA。

叶绿体分离的协议

原则

在叶绿体隔离方法中,首先使用搅拌器或均化器机械地破裂,然后进行过滤以除去未破旧的叶​​片组织和细胞碎片。通过使用Percoll梯度离心收集叶绿体,其是在改性二氧化硅溶胶“Percoll”上的密度梯度离心的形式。

Percoll梯度分离器适用于等式分离原则。在这种类型的分离中,特定密度的颗粒将在离心期间沉入,直到达到位置的位置与颗粒的密度完全相同的位置。一旦达到这种准平衡,离心的长度对颗粒的迁移没有任何影响,因此可以分离。

需要材料

  • 菠菜留下30克
  • 剪刀
  • 搅拌机和均质化器
  • 布布尔林布。
  • 离心管
  • 移液器
  • 冷却离心机。
  • 分光光度计
  • 1x叶绿体隔离缓冲液没有BSA:0.33M山梨糖醇,0.1M Tris-Cl pH 7.8,5mm MgCl2,10mm NaCl,2mm EDTA。
  • 1x叶绿体分离缓冲液,BSA(0.1%w / v)
  • 40%percoll:4ml percoll和6 ml 1x Cib缓冲液,BSA制成10ml 40%的Percoll。(使用10ml 40%的Percoll用于6ml叶绿体悬浮液)
  • 80%丙酮。

程序

  1. 采取新鲜收获的叶(菠菜)35克(湿重)
  2. 将叶子的米子静脉移入小区段(宽度1厘米)
  3. 用BSA将2秒混合2秒,立即均匀化2秒(pH6.1)
  4. 通过多层的Muslin布,简要过滤所得到的匀浆。
  5. 将滤液分成离心管,并在4℃下以2,500×g离心70秒。
  6. 将上清液转移到冷却的离心管中,并在1000xg下离心7分钟。将获得绿色颗粒。
  7. 丢弃上清液并通过手指敲击轻轻地打破绿色颗粒。
  8. 将颗粒与BSA中的2ml 1x Cib缓冲液中的颗粒重悬于2mL的1x Cib缓冲液中,并通过移掉和下降轻轻混合。将悬浮的颗粒汇集成一个离心管。
  9. 在Percoll中进行梯度离心。

制备40%的Percoll层:用BSA用6ml 1x Cib缓冲液混合4ml Percoll。

  1. 在该40%的Percoll层上轻轻覆盖6ml叶绿体悬浮液。
    以1700 XG离心6分钟。
  2. 小心地除去叶绿体悬浮液的上层,仅留下含有完整叶绿体的颗粒。
  3. 将颗粒与500μl的1x Cib缓冲液混合,没有BSA。
  4. 将悬浮液加入80%丙酮溶液(992UL中的10μl)混合和离心3000xg 2分钟。将上清液进入比色皿中,使用100ul 80%丙酮作为坯料测量650nm的吸光度,以坯料以估计叶绿素浓度如果需要。

预期结果

  • 作为绿色颗粒,在管中,在管底部的完整叶绿体沉积物。
  • 破碎的叶绿体将形成上层。

参考

  1. Amrita.edu,(2011)。叶绿体的分离。从vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=187&sim=878&cnt=2中检索2018年10月31日
  2. https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/sigma/bulletin/cpisobul.pdf.
  3. https://www.researchgate.net/publation_of_intact_and_pure_chloroplasts_from_leaves_of_arabidopesis_thiana_plants_acclimated_to_low_irradiance_for_studies_on_rubisco_regulation.
  4. Wang, S., Uddin, M. I., Tanaka, K., Yin, L., Shi, Z., Qi, Y., Mano, J., Matsui, K., Shimomura, N., Sakaki, T., Deng, X. and Zhang, S. (2014). Maintenance of chloroplast structure and function by overexpression of the rice MONOGALACTOSYLDIACYLGLYCEROL SYNTHASE gene leads to enhanced salt tolerance in tobacco. Plant Physiol 165(3): 1144-1155.
  5. 王,S.,Yin,L.,Mano,J.和Tanaka,K。(2015)。叶绿体内外包膜膜的分离。生物协议5(4):E1405。DOI:10.21769 / bioprotoc.1405。
  6. https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080 / 00021369.1979.10863766
  7. http://www.uky.edu/~jrawls/bio410/lab%20manualbfc.pdf.
  8. https://www.coleparmer.com/tech-article/basics-of-centrifugation.

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