脉冲场凝胶电泳（PFGE）

• 脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种用于大颗粒分离的技术脱氧核糖核酸（DNA）通过在凝胶基质上施加一个周期性改变方向的电场，分子就会发生变化。
• 由于大于15-20kb的DNA在凝胶中以大小无关的方式一起移动，标准凝胶电泳技术无法有效分离非常大的DNA分子，这导致了脉冲场凝胶电泳的实践。
• 1982年，施瓦茨提出了一个概念，即使用两个交变电场可以将大于50 kb的DNA分子分离。

脉冲场凝胶电泳原理（PFGE）

虽然在一般小片段中可以比大DNA片段更容易地通过凝胶基质找到它们的方式，但阈值长度存在于30-50kb以上，其中所有大碎片将以相同的速率运行，并且以凝胶显示为单个大漫射乐队。

然而，通过周期性改变场方向，各种长度的DNA对不同速率的变化反应。也就是说，当场方向改变时，较大的DNA将更慢地重新调整它们的电荷，而较小的碎片将更快。在随着时间的一致改变的时间内，每个频段即使在非常大的长度下也会开始越来越多地分开。因此，使用PFGE分离非常大的DNA片。

脉冲场凝胶电泳的方法（PFGE）

• 除了执行标准凝胶电泳之外，该技术的步骤相对相似，除了代替沿一个方向上不断地运行电压，电压在三个方向之间周期性地切换电压;穿过凝胶的中心轴的一个，两者以60度的角度运行。
• 每个方向的脉冲时间是相等的，导致DNA的净向前移动。

脉冲场凝胶电泳的主要步骤有:

• 溶菌作用:首先，将细菌悬液装入琼脂糖悬液中。这是为了保护染色体DNA不受机械损伤，将其固定成琼脂糖块。然后细菌细胞被裂解释放DNA。琼脂糖- dna悬液也被称为塞霉菌。
• 消化的DNA:细菌DNA被特殊的切割限制性内切酶处理，因此它产生的更大尺寸的DNA片段数量更少(与RFLP中经常使用的限制性内切酶相比，后者产生大量更小的片段)。
• 电泳:较大的DNA片段经过脉冲场凝胶电泳，通过施加电流并定期改变其方向(与传统的琼脂糖凝胶电泳相反，当电流以单一方向施加时，较小的片段被分离出来)。
• 分析:PFGE产生的不同生物的片段与手动或通过双抗辩生物等计算机软件进行比较标准。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)的应用

• 由于现场凝胶电泳允许分离含有高达100,000bp（100千碱基对或KBP）的DNA片段，这种大片段的表征使得从几种细菌种类的染色体的物理图构造。
• PFGE可用于基因分型或基因指纹。
• 它通常被认为是病原微生物流行病学研究的金标准。
• 亚型更容易区分不同的菌株单核细胞增多性李斯特氏菌从而将环境或食物分离物与临床感染联系起来。

脉冲场凝胶电泳的优点（PFGE）

• PFGE将DNA分离为超过10 MB的成对。
• PFGE亚型已成功应用于许多致病细菌的亚型，并具有高度一致的流行病学相关性。
• 对于许多细菌，PFGE已多次被证明比核糖核酸分型或多位点序列分型等方法更具有鉴别能力。
• PFGE基本格式相同，可作为细菌分型的通用通用方法。(只需要针对每种物种优化限制性内切酶和电泳条件的选择)
• PFGE所生成的DNA限制性内切模式稳定、重现性好。

脉冲场凝胶电泳的局限性

• 耗时。
• 需要训练有素的技术人员。
• 不区分所有不相关的隔离物。
• 模式结果在技术人员之间略有不同。
• 不能在凝胶的每个部分同时优化分离。
• 不知道同样大小的条带是不是相同的DNA片段。
• 乐队不是独立的。
• 一个限制站点的变化可能意味着多于一个频段变化。
• “亲缘关系”应该作为一种指导，而不是真正的系统发育衡量标准。
• 有些菌株不能通过PFGE进行分型。

参考

1. Bailey, W. R.， Scott, E. G.， Finegold, S. M.， & Baron, E. J.(1986)。贝利和斯科特的诊断微生物学。圣路易斯:处于。
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3. Parija S.C.（2012）。微生物学与免疫学教科书。（2 ED。）。印度：印度elessvier。
4. https://www.slideshare.net/pankajgaonkar31/pulse-field-gel-电泳
5. https://en.wikipedia.org/wiki/Pulsed-field_gel_electrophoresis
6. https://www.slideshare.net/jitenderanduat/pulsed-field-gel-electrophoresis-pfge
7. https://bitesizebio.com/29971/pulpulsed-delfer-gel-电泳/