表的内容
什么是实时PCR?
- 它是一种用于实时监测PCR反应进展的技术。
- 同时,可以对少量的PCR产物(DNA、cDNA或RNA)进行定量。
- 它基于通过增加的报告分子产生的荧光,随着反应进行的。
- 它也被称为a定量聚合酶链反应(QPCR),这是基于的分子生物学的实验室技术聚合酶链反应(PCR)。
- QPCR是一种强大的技术,允许指数扩增DNA序列。
- PCR反应需要一对引物,其与感兴趣的序列互补。引物由DNA聚合酶延伸。
- 扩增后产生的拷贝,即所谓的扩增子,用相同的引物重新扩增,从而导致DNA分子的指数级扩增。
- 然而,扩增后,凝胶电泳用于分析扩增的PCR产物,这使得传统的PCR耗时;由于反应必须在进行PCR后分析之前完成。实时PCR克服了这个问题。
- 术语“实时”表示当该过程与传统的PCR方法相比,该过程仅在进程完成后进行分析时,可以监视放大的进度。
PCR术语
聚合酶链反应 | PCR. |
逆转录聚合酶链反应 | RT-PCR. |
实时聚合酶链反应 | QPCR. |
RT-PCR / QPCR组合技术 | QRT-PCR. |
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Real Time PCR的原理
real-time PCR也采用了同样的扩增原理。但与观察反应结束时凝胶上的条带不同,反应过程是“实时”监控的。反应被放置到实时PCR仪中,用摄像机或探测器观察反应的发生。
虽然许多不同的技术用于监测PCR反应的进展,但所有的常见都有一件事。它们全部将DNA的扩增链接到产生的荧光的产生,这可以在每个PCR循环期间用相机进行简单地检测。因此,随着基因拷贝的数量在反应过程中增加,荧光使得表明反应的进展情况。
实时PCR的步骤(协议)
工作过程可分为两个步骤:
答:放大
- 变性
高温孵育用于将双链DNA“将”双链DNA“熔化成单链,并在单链DNA中松开二级结构。DNA聚合酶可以承受的最高温度通常使用(通常为95℃)。如果模板GC含量高,则可以增加变性时间。
- 退火
在退火期间,互补序列具有杂交的机会,因此使用适当的温度,其基于引物的计算熔融温度(TM)(5℃以下底漆的TM以下)。
- 扩展
在70-72℃下,DNA聚合酶的活性是最佳的,并且底漆延伸以每秒高达100个碱基的速率发生。当实时PCR中的扩增子很小时,该步骤通常使用60°C作为温度的退火步骤。
b .检测
- 检测是基于荧光技术。
- 首先将样品保持在正常PCR中的正常循环并进行热循环。
- 然而,在实时PCR中经受钨或卤素源,其导致荧光到添加到样品中的标记,并且信号随着样品DNA的拷贝数扩增而扩增。
- 发射的信号由检测器检测,并在转换成在屏幕上显示的数字信号之后发送到计算机。
- 当它出现阈值电平(检测器的最低检测水平)时,可以检测到信号。
实时使用的荧光标记物
实时使用许多不同的标记,但其中最常见的是:
- 塔克曼探测器。
- Sybr Green。
塔克曼探测器
- 它是一种水解探针,带有报告染料,通常是荧光素(FAM)在其5 '端和猝灭剂四甲基罗丹明(TAMRA),连接到寡核苷酸的3 '端。
- 突出的正常情况下,探针在本身上保持盘绕,使猝灭剂附近的荧光染料抑制或淬灭染料的荧光信号。
- Taqpolymerase的寡核苷酸与靶基因有一个同源区域,因此当靶序列出现在混合物中时,它与样本DNA结合。
- 随着taq聚合酶在延伸阶段开始给新的DNA链尺寸,它导致探针的5 '端核酸酶活性降解,荧光素从猝灭剂中分离出来,从而产生荧光信号。
- 随着这个过程的继续,在每个循环中,信号分子的数量增加,导致荧光的增加,这与目标的放大呈正相关。
SYBR绿色
- 这是一种染料,当它非特异性地结合在DNA的小沟槽上时,会发出突出的荧光信号。
- 其他荧光染料如溴化乙啶或吖啶橙也可以使用,但SYBR绿色是更好的,因为它的信号强度更高。
- Sybr Green比Taqman探针更优选,因为它可以提供有关每个放大循环的信息以及关于从Taqman探针获得的熔化温度。
- 然而,与Taqman Probe相比,它的缺点是缺乏特异性。
优势
它比常规PCR有很多优点:
- 它介绍了有助于确定哪种反应的反应良好,并且失败了。
- 可以精确计算反应的效率。
- 在反应之后,无需在凝胶之后在凝胶中运行PCR产物,因为熔体曲线分析服务于此目的。
- 实时荧光定量PCR数据可用于基因表达的真实定量分析。相比之下,老式的PCR充其量只是半定量的。
- 比正常的PCR快。
- 在样本的量化时较少的复杂性。
因此,与普通制备型PCR不同,实时PCR允许在仅几个循环之后自动测定多个PCR反应的成功,而不会对每个反应分析,并避免“假阴性”的问题。
应用程序
- 基因表达分析
- 癌症研究
- 药物研究
- 疾病诊断和管理
- 病毒量化
- 食品测试
- 转基因食物
- 动物和植物育种
- 基因拷贝数
参考
- https://www.mun.ca/biology/scarr/Principle_of_RT-PCR.html
- http://www.primerdesign.co.uk/assets/files/beginners_guide_to_real_time_pcr.pdf
- https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-90-481-3132-7_3
- https://www.slideshare.net/pratyayseth/real-time-pcr-34159486.
- https://www.thermofisher.com/np/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/esentials-real-time-pcr.html.
- https://www.sciencearect.com/topics/neuroscience/real-time-polymerase-chain-reaction.
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