重组DNA技术-步骤，应用和局限性

• 重组脱氧核糖核酸技术是指从两种不同物种中插入到宿主生物中的DNA分子的连接，以产生对科学，医学，农业和工业价值的新遗传组合。
• 另一方面，重组DNA (rDNA)是由至少两股DNA组合而成的DNA片段的总称。
• 它们是通过实验室基因重组(如分子克隆)的方法形成的DNA分子，将来自多个来源的遗传物质聚合在一起，创造出在基因组中无法找到的序列。
• 1973年，旧金山加利福尼亚大学的赫伯特·博耶和斯坦福大学的斯坦利·科恩首次实现了活体DNA重组大肠杆菌将外源DNA插入质粒。

基因重组技术的步骤

1. 遗传物质的分离

• rDNA技术的第一步是将所需的DNA以纯形式分离出来，即不受其他大分子的干扰。
• 由于在细胞膜内存在于细胞膜内，并且与其他大分子如RNA，多糖，蛋白质和脂质，因此必须分离和纯化，涉及酶如溶菌酶，纤维素酶，几丁质酶，核糖核酸酶，蛋白酶等。
• 其他大分子可以用其他酶或处理方法去除。最终，乙醇的加入导致DNA以细线的形式沉淀出来。然后把它卷起来，得到纯化的DNA。

2. 限制酶消化

• 限制酶充当分子剪刀，在特定位置切割DNA。这些反应称为“限制酶消化”。
• 它们涉及纯化的DNA与所选限制酶的培养，在该特定酶的优化条件下。
• 琼脂糖凝胶电泳技术揭示了限制性内切酶的研究进展。
• 该技术涉及在琼脂糖凝胶上耗尽DNA。在施加电流的情况下，带负电的DNA行进到正电极，并基于尺寸分离出来。这允许分离和切割消化的DNA片段。
• 载体DNA也是用同样的程序处理的。

3. 使用PCR扩增

• 聚合酶链反应或PCR是使用酶 - DNA聚合酶在体外制备多拷贝的DNA序列的方法。
• 它有助于将单副本或几份DNA副本扩展为数千万到数百万份。
• PCR反应在“热循环器”上运行，使用以下组件:

1. 模板 - 可扩增的DNA
2. 引物-化学合成的与DNA某一区域互补的小寡核苷酸。
3. 酶——DNA聚合酶
4. 核苷酸 - 所需的酶延伸引物。

• 可以使用PCR扩增DNA的切片片段，然后用切割载体连接。

4. DNA分子的连接

• 用相同的限制酶切割纯化的DNA和感兴趣的载体。
• 这给了我们DNA的切割片段和现在已经打开的切割载体。
• 使用酶“DNA连接酶”将这两个两块连接在一起的过程是'连接'。
• 得到的DNA分子是两个DNA分子的杂交物 - 利益分子和载体。在遗传学术语中，这种不同DNA链的混合称为重组。
• 因此，这种新的杂合DNA分子也称为重组DNA分子，并且该技术被称为重组DNA技术。

5. 将重组DNA插入到宿主中

• 在这一步中，重组DNA被引入宿主细胞，主要是细菌细胞。这个过程就是“转变”。
• 细菌细胞不易接受外来DNA。因此，他们被处理使他们“有能力”接受新的DNA。使用的工艺可能是热冲击，Ca⁺⁺离子处理、电穿孔等。

6. 分离重组细胞

• 转化过程产生转化和非转化宿主细胞的混合群。
• 选择过程涉及仅滤除变换的主机单元。
• 利用质粒载体的标记基因从非重组细胞中分离重组细胞。
• 例如，PBR322质粒载体含有不同的标记基因（氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。当使用PST1 RE时，将氨苄青霉素从质粒中敲出氨苄青霉素，使重组细胞对氨苄青霉素变敏感。

重组DNA技术的应用

• 重组DNA广泛应用于生物技术、医学和科研领域。
• 重组DNA最常见的应用是基础研究，其中该技术对于生物和生物医学科学的大多数工作是重要的。
• 重组DNA用于识别、定位和排序基因，并确定它们的功能。
• 重组蛋白广泛用作实验室实验中的试剂，并产生用于检查细胞和生物体中的蛋白质合成的抗体探针。
• 重组DNA的许多额外的实际应用在工业，食品生产，人类和兽医，农业和生物工业中发现。

1. DNA技术也被用于检测人体是否存在艾滋病病毒。
2. 重组DNA技术在农业上的应用——例如，生产bt棉以保护植物免受球虫侵害。
3. 药物的应用 - 胰岛素生产DNA重组技术是一种典型例。
4. 基因治疗 - 它被用作纠正引起遗传疾病的基因缺陷。
5. 临床诊断- ELISA是应用重组DNA的一个例子。

重组DNA技术的局限性

• 在环境中破坏天然物种遗传修饰的物种。
• 有着弹性的植物理论上可以产生难以控制的弹性杂草。
• 生物间专有DNA的交叉污染和迁移。
• 污染自然环境的重组生物。
• 重组生物是克隆的群体，以完全相同的方式易受攻击。单一疾病或害虫可以快速消除整个人口。
• 创建超级萎缩是假设的。
• 关于人类试图扮演上帝，扰乱自然选择方式的伦理担忧。它被一种未知的恐惧所夸大，这种恐惧是关于使用技术可以创造出什么，以及它将如何影响人类文明。
• 这种系统可能导致人们的基因信息被窃取和未经许可使用。
• 许多人担心使用重组DNA技术修改食品和药物的安全性。

参考

1. Verma，P. S.，＆Agrawal，V. K.（2006）。细胞生物学，遗传学，分子生物学，演化与生态学（1 ED。）。S .Chand和Company Ltd.
2. Klug, W. S. & Cummings, M. R.(2003)。遗传学的概念。上马鞍河，新泽西州:普伦蒂斯霍尔。
3. https://byjus.com/biology/recombinant-dna-technology/
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Recombinant_DNA
5. https://www.britannica.com/science/recombinant-dna-technology
6. https://www.quora.com/what-are-theactages-and-disadvantares-of-recombinant-dna。