限制性片段长度多态性(RFLP)

• 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)是一种通过分析生物的裂解而得到的模式来区分生物的技术DNA．
• 这是一种利用同源DNA序列变异的技术。
• 限制性片段长度多态性是由与限制性片段相关的可选等位基因的存在定义的，这些等位基因的大小彼此不同。简单地说，一个物种的个体之间限制DNA片段长度的变化被称为RFLP。
• 识别这种限制性片段长度多态性的基本技术包括用限制性内切酶将DNA样本分裂，这种酶可以识别并切割任何特定短序列出现的DNA，这个过程被称为限制性内切消化。
• 然后通过琼脂糖凝胶电泳按长度分离得到的DNA片段，并通过Southern blot程序转移到膜上。将膜与标记的DNA探针杂交，然后确定与探针互补的片段的长度。
• 当检测到的片段长度因人而异时，就会发生RFLP。
• 尽管由于廉价的DNA测序技术的兴起，RFLP分析现在基本上已经过时，但它是第一个廉价到可以寻求广泛应用的DNA谱分析技术。

限制性片段长度多态性(RFLP)的原理

如果两个生物在特定限制性内切酶的裂解位点之间的距离不同，当DNA被限制性内切酶消化时，产生的片段长度也会不同。由此产生的模式的相似和不同可以用来区分物种(甚至品系)。

限制性片段长度多态性(RFLP)的步骤

1. 这个过程的第一步是分离DNA从目标。
2. 一旦DNA从样本中分离出来受限制消化使用限制性内切酶。
3. 消化后的DNA样本会被凝胶电泳在这种方法中，DNA根据其大小被分离。产生了许多长度略有不同的DNA片段。
4. 然后将凝胶暴露在一种化学物质中，使双链DNA变性为单链DNA。
5. 接下来是南印迹，DNA从凝胶转移到尼龙膜上。
6. 然后将尼龙膜暴露在含有放射性互补核苷酸探针的溶液中，该探针与尼龙膜上特定选择的DNA序列杂交。
7. 然后将该膜与X射线膜放在一起，在X射线膜上，杂化的放射性探针引起X射线膜的暴露，产生自辐射图。
8. RFLP分析用于检测模式的差异，以确认多态性。

限制性片段长度多态性(RFLP)的应用

RFLP分析以前是基因组绘制、遗传病基因定位、确定疾病风险和亲子鉴定的重要工具。

RFLP可用于许多不同的设置，以实现不同的目标:

1. 在亲子关系案件或刑事案件中确定DNA样本的来源。(即它具有司法应用)。
2. 确定一个人的疾病状况。(例如，它可以用于检测突变)
3. 测量重组率，从而得出RFLP位点间距离的遗传图谱。
4. 在动物种群的遗传多样性或繁殖模式的特性中。
5. RFLP已被开发用于人类、小鼠、玉米、番茄、水稻等的染色体定位。

限制性片段长度多态性(RFLP)的优点

• RFLP分析相对于基于pcr的协议的主要优势是不需要预先的序列信息，也不需要寡核苷酸合成。
• 结果是基于可靠的基因型特征，而不是表型。
• 基于RFLP的遗传标记
• RFLP是共显性标记，可以估计杂合度。
• RFLP &在基因组DNA序列研究中是非常有用的。
• 具有良好的实验室间可移植性的高鲁棒性方法。

限制性片段长度多态性(RFLP)的局限性

• 慢
• 麻烦
• 需要大量的DNA样本。
• 自动化不可能
• 某些物种的多态性水平较低
• 每次试验检测到的位点很少
• 需要一个合适的探测库
• 需要探针标记、DNA片段、电泳、印迹、杂交、洗涤和放射自显影的组合过程。

参考文献

1. https://www.slideshare.net/ferisaber/rflp-55298956
2. https://www.slideshare.net/orampo/restriction-fragment-length-polymorphism-29253376
3. http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_fragment_length_polymorphism
5. https://www.princeton.edu/~lsilver/book/MG8.html
6. https://www.slideshare.net/ArunimaSur/rflp-rapd
7. https://cropgenebank.sgrp.cgiar.org/images/file/learning_space/molecular_markers/volume1/RFLPs.pdf