RNA隔离协议

细菌细胞总RNA的分离

RNA分离原理

总计核糖核酸用一种叫做Trizol的溶液提取后，从DNA和蛋白质中分离出来。Trizol是一种酸性溶液，含有硫氰酸胍(GITC)，苯酚和氯仿。GITC使蛋白质和rnase不可逆变性。接下来是离心。在酸性条件下，总RNA停留在上水相，而大部分DNA和蛋白质停留在间相或下有机相。然后用异丙醇沉淀回收总RNA。加入二乙基碳酸吡啶(DEPC)可以使RNase酶失活。

RNA分离所需材料

• 细菌培养
• 试剂盒
• 氯仿
• 异丙醇溶液
• TAE缓冲
• 70%的乙醇

RNA分离步骤

1. 取800 μL新鲜ependorf培养液。
2. 加入Trizol 160 μL(培养体积的1/5)。
3. 经过几次移液，溶液混合得很好。
4. 在此基础上加32 μl氯仿(三唑的1/5体积)。
5. 培养2至5分钟，在4°C 12000 rpm离心15分钟
6. 将水相转移到新管中，加入等量的异丙醇。拌匀。
7. 离心10000转/分，4°C 10分钟。
8. 弃去上清液，用70%乙醇重悬颗粒。•再次离心10000转/分，4°C 10分钟。
9. 浮在表面的丢弃。
10. 37°C风干颗粒10-15分钟。
11. 重悬于50 μL TE缓冲液中。
12. 对RNA样本进行定量和定性分析。

从动物细胞或组织中分离RNA

材料试剂

• 试剂盒试剂
• 氯仿

仪器

• 通风柜
• 涡
• 微量吸液管
• 冷却微型离心机
• 颗粒杵均质器

过程

1. 用破坏RNases的表面去污溶液清洁工作台(移液器轴，工作台)。
2. 将微离心机冷却至4ºC。
3. 匀浆新鲜组织或细胞培养:

• 新鲜组织是最佳RNA分离的优选。或者，解剖后组织应立即浸泡在RNA稳定剂中，并保存在-80°C。
• 每100mg新鲜组织加入1ml TRIzol试剂，用无菌手术刀剁碎放在冰上，用无菌球杵探针匀浆。
• 如果是细胞培养，从培养箱取出后应立即处理。
• 在室温下(15-25ºC)将300 x g悬浮培养的细胞离心5分钟，丢弃上清或从单层培养的细胞中去除培养基。
• 每1 × 10加入1ml TRIzol试剂⁷细胞对细胞微球或直接对单层培养细胞的培养皿或烧瓶。用无菌一次性1ml移液管头重悬裂解液。

4. 将组织或细胞裂解液转移到2毫升硅化低滞留管中。
5. 用一次性21g无菌针头取样10次。在此过程中，高分子量的细胞成分(DNA)被分解，从而最大限度地减少它们在水相中的存在。
6. 匀浆置于RT(15-25ºC)下静置5分钟，使核蛋白复合物完全解离。
7. 将匀浆置于室温(15-25ºC)下静置3分钟。
8. 在4°C, 12000 x g离心15分钟。离心后，将离心机加热至室温(15-25℃)。
9. 转移上水相(600 ul)到新的1.5 ml RNase-free管。
10. 进行酒精沉淀。
11. 与异丙醇混合使RNA从水相中沉淀。每1ml TRIZOL试剂中使用0.5 ml异丙醇，用于初始均质化。
12. 在15 - 30℃下培养样品10分钟，在2 - 4℃下不超过12,000 x g离心10分钟。
13. 完全取出上清液。用75%乙醇清洗RNA颗粒一次，每1ml TRIZOL试剂中加入至少1ml 75%乙醇，用于初始匀浆。
14. 在2 - 8℃下，用不超过7500 x g的涡旋和离心机混合样品5分钟。重复。
15. 将RNA颗粒风干或真空干燥5-10分钟。
16. 将RNA溶解在depc处理过的水中，通过移液管尖端几次传递溶液。
17. 以分光光度法分析确定样品的浓度和纯度。

预期结果

• 在RNA管的侧面和底部有一个凝胶状的颗粒沉淀。
• 在260 nm和280 nm处取OD时，A260/A280比应在1.6以上。

参考

1. http://www.srmuniv.ac.in/sites/default/files/files/BT0210%20%20MOLECULAR%20BIOLOGY%20LABORATORYMANUAL.pdf
2. “用酸硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取法分离RNA的一步法:20多年后”。自然议定书1(2):581-585;2006.
3. Cox RA和Arnstein HRV。物化学。"兔网红细胞核糖体中核糖核酸的分离、鉴定和酸碱性质"j . 89, 574;1963.
4. http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason/lab/zumbo/files/PHENOL-CHLOROFORM.pdf
5. https://dir.nichd.nih.gov/dirweb/lcm/LCMTAP.htm#I.%20Preparation,%20LCM%20and%20RNA/DNA%20extraction%20of%20Frozen%20Tissue%20Sections
6. https://www.labome.com/method/RNA-Extraction.html
7. http://www2.lbl.gov/LBLPrograms/lifesciences/BissellLab/labprotocols/rnaextraction.htm
8. https://medicine.yale.edu/keck/ycga/microarrays/protocols/TRIZOLRNAIsolation_092107_21453_284_10813_v1.pdf