银染色原理，程序，应用

什么是银染?

银染色是一种特殊但强大的染色技术，用于检测和识别蛋白质在凝胶中。

• 这是因为银与氨基的化学终端或侧链粘合I.E羧基和巯基。
• 现在已经使用了几十年来分离聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质。
• 在蛋白质中存在着微小的裂缝，在那里可以保持自由的气液表面，从而促进银离子的甲醛还原成微小的银晶体，这有利于银离子的检测。
• 银染色法检测蛋白质是一种高灵敏度的方法，但对蛋白质具有特异性和选择性。它产生的图像减少了背景和更少的质谱干扰。
• 银染色的一般程序包括固定银，敏化，银的浸渍和图像的发展．这种技术的几种变体出现了，一些时间在一个小时内进行，其他人服用超过24小时完成。
• 然而，末端染色在失去观察效果前可以保持稳定几周。

银染色原则

银染色有两种主要方案，由银浸渍的阶段定义。

1. 碱性协议
   • 这种方法在由铵和氢氧化钠组成的碱性空间中使用硝酸银的二胺络合物。
   • 蛋白质图案是在甲醛稀酸溶液中进行的。
2. 酸性的协议
   • 该方法使用硝酸银溶液在水中进行凝胶浸渍，蛋白质图案在氨基和氢氧化钠的碱性环境下在甲醛溶液中开发。

• 主要是，银染色技术是一种简单的方法，用于在接近蛋白质分子的起始位点的选择性减少，以不溶性金属银。
• 银染色的阶段是：
  • 固定蛋白质的固定，除去任何干扰化合物。
  • 凝胶处理与加速蛋白质反应性与银和/或银还原（敏化和洗涤）的元素处理。
  • 用硝酸银或氨银浸渍银。
  • 凝胶冲洗，获得银金属图像。
• 产生的图像色调取决于连接到银的蛋白质带的数量。
• 银染色蛋白条带根据染色银的颜色强度呈现深棕色或黑色。
• 颜色的变化是由于不同大小的银颗粒的散射衍射造成的。

银色污渍的性质

• 它的沸点是2162°C(3924°F)
• 它的熔点是961.78°C(1763.2°F)
• 蒸发热量：254 kJ / mol
• 它的密度为10.49g / cm3
• 摩尔热容量：25.350 j /（mol·k）

银染色试剂和溶液

• 样本缓冲器
• 3％丙烯酰胺溶液：通过在7.25ml水中混合2.0ml 0.8m Tris-HCl，pH 8.6,0.75ml 38.9％（w / v）丙烯酰胺和1.1％（w / v）双丙烯酰胺和8毫克过硫酸铵
• 20%丙烯酰胺溶液:2.0 ml 0.8 M Tris-HCl, pH 8.6, 38.9%丙烯酰胺5.0 ml, 1.1%双丙烯酰胺，3ml水，8mg过硫酸铵配制。
• 通过混合40％乙醇，10％乙酸，50％水制备固定溶液
• 蛋白质处理溶液由20%乙醇，5%乙酸，75%水，4mg二硫苏糖醇混合而成
• 0.5％的二元盐
• 0.1%硝酸银
• 用0.02%多聚甲醛，3%碳酸钠制备配合物形成溶液
• 1％乙酸

银染色程序

• 有银染色技术的协议变体，但我们将讨论两个最重要的两种。
• 最初，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）之后进行银染色技术。

步骤1：SDS-PAGE

1. 在10 μL的样品缓冲液中加入20 μg蛋白，室温静置60分钟后分离。
2. 使用梯度混合器填充3％丙烯酰胺溶液和20％丙烯酰胺溶液中的每一个。将溶液以5ml / min的流速泵入玻璃比色杯中。
3. 将蛋白样品装入凝胶中，使用跟踪凝胶，最好是酚红。
4. 在4°C下运行SDS-PAGE凝胶，电泳电流为15 mA。
5. 使用牛血清白蛋白计算蛋白质浓度。

步骤2A：银染色

6. 加入固定溶液30分钟以固定凝胶。
7. 用蛋白质处理溶液处理凝胶30分钟。
8. 用0.5％的二甲酸酯冲洗凝胶5分钟。
9. 用水清洗凝胶5分钟。
10. 将凝胶与0.1％硝酸银30分钟平衡。
11. 用水洗凝胶1分钟。
12. 使用复合物形成溶液，将凝胶孵育在pH12处。
13. 为了停止复杂的形成，加入1％乙酸。
14. 将凝胶固定到玻璃或聚酯片上，用于观察和/或储存。

步骤2B:长时间硝酸银染色

1. SDS-PAGE电泳后，在30%乙醇和10%乙酸中固定60分钟。
2. 更换固定浴，过夜。
3. 使用四分离化敏化溶液敏化凝胶45分钟。
4. 用20%乙醇分两部分冲洗凝胶(两次)，每次至少10分钟。
5. 用清水冲洗凝胶四次，每次10分钟。
6. 用12mm硝酸盐浸渍凝胶。
7. 将浸泡在硝酸银中的凝胶放在一个盒子里，盒子里有一半的水，基本显影剂，和一个含有停止溶液(每升40克Tris和20毫升醋酸)的盒子里。
8. 用去离子水冲洗，并将凝胶拉出银溶液。
9. 在水浴中浸泡10秒钟，然后转移到基本显影液中。
10. 通过振动含有含有盒子的盒子来重新溶解沉淀物。
11. 在达到染色程度后，将凝胶转移到Tris-stop溶液中30分钟。
12. 用水清洗凝胶，想象它或储存它。

图：用银色染色套件染色的凝胶。图像来源：Polysciences，Inc。

银染色的应用

• 一般情况下，银染色是并可作为诊断细菌和真菌感染的工具，如引起的感染假单胞菌应用，梅毒螺旋体，幽门螺杆菌，军团菌，钩端螺旋体，巴尔通体，肺孢子虫，念珠菌，组织原体，隐球菌。所有这些有机体都在银色染色中染色。
• 它用于检测和可视化蛋白质
• 它可以用来识别蛋白质的结构差异
• 它可以定量地确定样品中蛋白质的数量
• 它还可以通过检测来自样品的DNA和RNA分子来用于基因组分析
• 该方法还可用于SDS-PAGE检测细菌脂多糖
• 它可用于检测真菌脂多糖，例如肝脏活组织检查中的组织

银染色的优点

• 执行简单。
• 这更便宜
• 它是可靠的
• 它非常敏感
• 它的持久性和简单性使得比荧光探针更好
• 它也可以用来染色DNA和RNA

银染色的缺点

• 它的背景高而不稳定
• 它需要强烈的蛋白质与蛋白质联系以进行可变性。

参考资料和来源

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