什么是Southern Blotting?

南部吸去定义

• 将凝胶上分离的特定DNA、RNA或蛋白质转移到载体膜上进行检测或鉴定的分析技术称为印迹技术。
• 将变性片段从凝胶中转移到载体膜上的过程使其易于使用探针或抗体进行分析。
• 根据被分离物质的不同，印迹技术可以是- Southern印迹、Northern印迹或Western印迹，分别分离DNA、RNA和蛋白质。
• 印迹是一种用于分子生物学、免疫遗传学和其他分子方法的分析技术，用于从DNA样本的混合物或DNA链中的特定碱基序列中检测或识别感兴趣的DNA。
• 这项技术是由分子生物学家E.M. Southern在1975年开发的，用于分析DNA限制性片段中的相关基因，因此以他的名字命名为Southern blotting。

原则南部的印迹

该过程包括将电泳分离的DNA片段转移到通常是硝化纤维素的载体膜上，然后通过探针杂交检测目标DNA片段。杂交是指单链DNA探针和单链靶DNA之间形成双链DNA分子的过程。由于探针和靶DNA是互补的，因此反应具有特异性，有助于特异性DNA片段的检测。

Southern Blotting的步骤

1. 从细胞中提取和纯化DNA

首先，按照提取基因组DNA的标准方法从靶细胞中分离出DNA，然后进行纯化。

2. 酶切或DNA片段

限制性内切酶用于将高分子量的DNA链切成更小的片段。可以使用一种或多种限制性内切酶来获得这样的片段。

3. 通过电泳分离

这种分离可以通过琼脂糖凝胶电泳完成，在电泳过程中，带负电荷的DNA片段向带正电荷的阳极移动，距离取决于其大小。

4. 脱嘌呤

部分脱嘌呤是通过使用稀释的盐酸来完成的，通过将DNA片段分解成更小的片段，可以提高DNA片段转移的效率。

5. 变性

然后用温和的碱，如氢氧化钠溶液使DNA变性。这使得双链DNA变成单链，使它们适合杂交。在加入探针之前，用NaCl中和DNA以防止再次杂交。

6. 印迹

变性后的碎片被转移到尼龙或硝化纤维过滤膜上，这是通过将凝胶放在缓冲饱和滤纸上，然后在凝胶的顶部铺上硝化纤维过滤膜完成的。最后，将一些干燥的滤纸放在膜的上面。碎片被毛细管作用拉向硝化纤维素滤膜，形成凝胶的接触印。

7. 烘焙

将硝化纤维素膜从印迹层上取下，将附着单链DNA带的膜在真空或普通烤箱中80°C下烘烤2-3小时，或将转移的DNA永久附着在膜上。

8. 杂交

然后将膜暴露在杂交探针中，杂交探针是具有特定序列的单个DNA片段，其在目标DNA中的存在有待确定。通常通过加入放射性物质或用荧光或显色染料标记分子，探针DNA被标记以便被检测到。

9. 清洗未绑定的探针

杂交后，用缓冲液彻底冲洗膜，去除非特异性结合的探针或任何未结合的探针。

10. 放射能照像

杂交区是通过将硝化纤维素膜与显示杂交DNA分子的照相胶片相接触来检测的。如果使用放射性或荧光探针，则通过自放射线照相在x射线胶片上显示杂交模式;如果使用显色检测方法，则通过在膜上显色来显示杂交模式。

Southern Blotting的应用

• 在DNA样本中识别特定的DNA。
• RFLP(限制性片段长度多态性)图谱的制备
• 检测DNA中的突变、缺失或基因重排
• 用于刑事鉴定和DNA指纹(VNTR)
• 转基因个体中转基因基因的检测与鉴定
• 限制点地图
• 用于传染病的诊断
• 癌症的预后和遗传病的产前诊断
• 测定限制性片段的分子量，并测定不同样品中的相对含量。