Southern污染定义，原理，步骤，结果，应用

通过

印迹定义

Southern blot是将DNA片段通过电泳分离到膜上进行固定和鉴定的过程。

  • Southern印迹已被采用作为分析不同应用的DNA样品的常规程序。
  • 这项技术是由埃德温·索恩发现的，并以他的名字命名。这种技术后来又产生了其他的技术，比如西方墨点法和基于相同原理的Northern Blotting。
  • 该技术的最基本形式用于从基因组DNA的复杂混合物确定DNA片段的大小。
  • 这项技术也是相对定量的，可以用来确定基因组中一个片段的拷贝数。
  • Southern Blotting可以根据膜、转移缓冲液和方法的选择进行修改。最常用的膜是硝化纤维素膜，因为它很结实，可以反复检测多次。
  • 同样，南方印迹的原始方案利用了放射性探针;然而，其他利用荧光和化学发光的标记系统。
  • Southern blotting在许多方面进行了改进，以更好地服务于应用，并使其更加复杂和高效。
印迹
南方的污点。创建BioRender.com

南方印迹原则

  • Southern印迹原理类似于涉及将生物分子转移到膜的印迹技术与另一个用于检测和鉴定的印迹技术。
  • 用限制酶消化待分析的DNA，并通过尺寸进行分馏琼脂糖凝胶电泳．
  • 碱法使DNA链变性，通过印迹法将其转移到尼龙或硝化纤维素膜上。
  • 通过烘烤或紫外线照射将膜上的链固定在膜的表面。通过杂交可以检测膜上的DNA序列。
  • 杂交反应是特异的，因为所用探针与由互补序列组成的靶片段结合。
  • 所使用的探针标有不同的组件，根据所使用的探针类型，可以用不同的方法来显示这些组件。

要求

设备

  • 水浴
  • 琼脂糖凝胶
  • 电源
  • 紫外线辐射
  • 杂交炉
  • 杂交瓶子
  • 托盘
  • 电影处理器
  • 吸量管
  • 离心管
  • 玻璃板
  • Whatman 3毫米色谱纸
  • 尼龙膜/硝酸纤维素膜
  • 注射器
  • 醋酸纤维素膜

材料

  • 限制性内切酶
  • 限制性内切酶的缓冲
  • 琼脂糖
  • 缓冲区
  • DNA加载缓冲区
  • 三基地
  • 氯化钠
  • 氢氧化钠
  • 柠檬酸钠
  • DNA标签设备
  • 核酸检测试剂盒
  • 十二烷基硫酸钠(SDS)
  • 聚乙烯吡咯烷酮
  • 牛血清白蛋白
  • 甲酰胺
  • 苯酚

解决方案和缓冲区

  • 变性缓冲液:NaOH和NaCl的比例为1:6
  • 中和缓冲液:Tris-HCl和NaCl的比例为5:3
  • SSC: NaCl 175.3 g，柠檬酸钠88.2 g，蒸馏水1L。
  • 检测缓冲液：Tris-HCl和NaCl的比率5：1。

Southern Blot程序

一种。DNA的限制消解

  • 用在微量加压管中用适当的限制酶消化约10μg提取的基因组DNA。
  • 试管在37°C孵育过夜。在某些情况下，试管在孵育后在65°C的水浴中加热20分钟，使限制性内切酶变性。
  • 向管中加入10μl的DNA样品缓冲液，将混合物倒入琼脂糖凝胶上进行电泳。

Southern Blot程序

图像来源：生物学LibreTexts．

湾电泳

  • 凝胶的百分比和大小是根据要分离的DNA片段的大小来确定的。然后相应地制备凝胶。
  • 用溴化乙锭制备电泳缓冲液，并以凝胶载体上方几毫米的方式倒入罐中。
  • 凝胶铸件与牙齿的梳子一起制备，以形成可以保持样品体积的孔。一旦梳子到位，凝胶就会将凝胶慢慢倒入铸造中。
  • 一旦凝胶凝固，就把梳子拿下来，把凝胶放在容器上。
  • 将运行缓冲液添加到槽中以覆盖凝胶。
  • 样品通过加入加载缓冲液并小心地移液到孔中制备。
  • 油箱与电源连接，并允许运行一整夜。

C。变性

  • 将凝胶从电泳仪中取出，在室温下放入装有500 ml变性缓冲液(1.5 M NaCl和0.5 M NaOH)的玻璃托盘中45分钟。
  • 倒出变性缓冲液并用中和缓冲液替换。凝胶被允许浸泡1小时，同时在平台旋转器上慢慢旋转。

d。印迹

  • 略大于凝胶的长圆形海绵放在玻璃盘上，玻璃盘子填充有SSC以将浸泡的海绵留在缓冲液中的半浸没。
  • 3张Whatman 3毫米的纸被切成和海绵一样大小。这些被放置在海绵和湿的SSC。
  • 将凝胶放在滤纸上并通过在表面上滚动玻璃移液管挤出以除去气泡。
  • 尼龙膜，足够大的以覆盖凝胶的表面被置于凝胶的顶部。用SSC进一步淹没膜，少量滤纸放置在其顶部。
  • 最后，将玻璃板放在结构的顶部，以保持一切到位。使DNA转移在一夜之间发生。

e。烘焙/固定

  • 从印迹结构中除去尼龙膜，并在80℃下连接到真空或常规烘箱2-3小时。
  • 膜上的DNA链也可以通过将膜暴露于紫外线辐射来固定。

f。杂交

  • 杂交探针可以是一个DNA片段，也可以是一个具有特定序列的RNA片段，以检测目标DNA。
  • 探针核酸被标记为可以通过将放射性掺入或标记用荧光或发色染料标记分子来检测。
  • 在这个过程中，条件的选择是通过一种方式，即探针与细胞膜上的互补序列杂交目标DNA。
  • 杂交之后用缓冲液清洗，以去除非特异性结合或未结合的探针，使只有标记的探针仍然与目标序列结合。

G。检测

  • 膜上的杂交区域可以通过将尼龙膜与照相胶片接触而通过放射自显影来检测。
  • 图像显示了杂交DNA分子的位置，可以用来确定片段的长度，通过与已知长度的标记DNA分子进行比较。
  • 类似地，图像还提供关于杂交片段的数量及其尺寸的信息。
  • 如果使用荧光或显色染料，则可以在X射线膜上或通过膜上的颜色显影来观察这些荧光染料。

结果Southern Blot分析

  • Southern印迹的结果在膜上以条带的形式被观察到。DNA片段的大小可以通过与已知长度的DNA带的相对大小进行比较来确定。

南方印迹的应用

  1. Southern blotting在基因发现、绘图、进化和诊断研究等领域有许多应用。
  2. 该技术可用于DNA分析，以检测点突变和DNA序列中的其他结构重排。
  3. 该方法还允许确定限制片段的分子量，这有助于分析这种片段。
  4. 由于该技术能够检测特定的DNA片段，因此可以用于通过指纹识别个人身份。
  5. 它可用于疾病诊断以及遗传疾病的产前诊断。

Southern Blot的局限性

  1. 与其他测试相比，这种方法需要昂贵的设备和试剂，因此成本很高。
  2. 它是一个由多个步骤组成的复杂过程。该过程也是劳动密集型，需要培训人员。
  3. 它是一种耗时的过程，可以由聚合酶链反应等其他更快的方法所取代。
  4. 这是一个半定量的过程，只提供DNA片段的估计大小。
  5. Southern印迹不是一种用于检测碱基对水平突变的合适方法。
  6. 该样品需要大量的样品和高质量的DNA，通过优越的分离方法。

参考文献

  1. Brown T. Southern印迹法。Curr方案免疫。2001年5月;第十章:10.6单位。im1006as06 doi: 10.1002/0471142735.。PMID: 18432697。
  2. 南方e，南方印迹。Nat Protoc。2006;1(2):518 - 25所示。doi: 10.1038 / nprot.2006.73。PMID: 17406277。
  3. Glenn G, Andreou LV用Southern blotting分析DNA。方法Enzymol。2013;529:47 - 63。doi: 10.1016 / b978 - 0 - 12 - 418687 - 3.00005 - 7。PMID: 24011036。

来源

  • https://www.mybiosource.com/learn/southern-blotting/ - 14%
  • https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological--ciences/southnslotting - 11％
  • https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot - 3%
  • https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124186873000057 - 1%
  • http://www.radio.cuci.udg.mx/bch/es/papers/southellot_currprotmolbiol_1999-u2.9.1.pdf - 1％
  • https://magadhuniversity.ac.in.in/download/econtent/pdf/blotting.pdf - 1％

还读......

留下你的评论

本网站使用AkisMet减少垃圾邮件。了解如何处理您的评论数据．