病毒培养和方法

• 病毒是专性细胞内寄生虫，依赖宿主生存。
• 它们不能在非活的培养基或琼脂皿中单独生长，它们必须需要活细胞来支持它们的复制。
• 病毒培养的主要目的是:
  • 分离和鉴定临床样本中的病毒。通过培养在适当的临床标本中证明病毒可以确定病毒性疾病的诊断。
  • 研究病毒的结构、复制、遗传及对宿主细胞的影响。
  • 为疫苗生产准备病毒。
  • 病毒分离一直被认为是确定一种疾病的病毒病原学的金标准。
• 大多数病毒都可以在里面培养
  • 实验动物
  • 胚胎蛋或者
  • 组织文化。

病毒培养标本

适当的临床标本的收集取决于病毒疾病的类型。例如，脑脊液(CSF)是诊断虫媒病毒、小核糖核酸病毒或狂犬病毒引起的中枢神经系统(CNS)病毒感染的首选标本。

动物接种

• 小鼠是通过动物接种分离病毒最常用的方法。
• 此外，兔子、仓鼠、新生或哺乳的啮齿动物也被使用。
• 实验动物很少用于病毒的培养，但在研究病毒感染的发病机制和病毒肿瘤发生中起着重要作用。
• 脑内，皮下，腹膜内或鼻内途径是各种接种途径。
• 接种疫苗后，观察动物是否有疾病或死亡的迹象。
• 然后处死受感染的动物，并且通过各种试验检查病毒的存在，并且还在受感染组织中的包涵体进行病毒的存在。
• 利用幼鼠分离柯萨奇病毒和狂犬病毒。

胚胎蛋

• 1931年，good牧草首次将鸡胚蛋用于病毒培养。
• Burnet进一步发展的方法被用于在胚蛋的不同部位培养病毒。
• 通常用8-11天的鸡蛋培养病毒。
• 病毒在卵黄囊、羊膜腔、尿囊腔、绒毛膜尿囊膜等不同部位分离。
• 许多这些病毒引起明确的和有特征的焦点，提供了一种识别、量化或评估病毒致病性的方法。
• 胚胎卵还用于研究实验室和疫苗生产中一些病毒的滴度滴度。
  • 卵黄囊:Yolk Sac接种用于培养日本脑炎，圣路易斯脑炎和西尼罗病毒。它还用于衣原体和Rickettsia的生长。
  • 羊水：羊膜腔接种主要用于流感病毒的初步分离。
  • Allantoin腔：口腔中的接种用于串行通道，用于获得大量病毒，例如流感病毒，黄热病（17D菌株）和狂犬病（呋喃特征）病毒，用于制备疫苗。对于狂犬病病毒的生产，由于它们的尺寸更大，因此使用鸭蛋而不是母鸡的鸡蛋。这有助于生产大量的狂犬病病毒，其用于制备灭活的非神经狂犬病疫苗。
  • 绒毛膜尿囊的膜:在CAM上接种一些病毒会产生可见的称为痘的损伤。每一个传染性病毒粒子都会产生一个麻袋。痘病毒，如天花或牛痘，是通过在接种了痘病毒的凸轮上出现典型的丘疹来识别的。现在，在病毒学实验室，用细胞培养代替鸡胚接种进行病毒分离。

组织培养

• 细胞培养在诊断病毒学中广泛用于病毒的培养和检测。
• 组织培养首先在1913年的Steinhardt及其同事施用诊断病毒学。
• 他们通过兔角膜组织中的培养保持疫苗病毒。随后，Maitland（1928）使用营养培养基中的切割组织以培养疫苗病毒。
• Enders, Weller, and Robins(1949)是第一个在非神经来源的组织培养中培养脊髓灰质炎病毒的人。从那时起，大多数病毒在组织培养中培养，用于诊断病毒性疾病。
• 不同类型的组织培养被用来培养病毒。组织培养可分为以下三种不同类型:

器官文化

• 这是前面使用的用于分离一些病毒，这似乎为某些组织器官表达了亲和力。例如，在气管环形器官培养中分离出呼吸道病原体冠状病病毒。
• 在这种方法中，小块器官在体外保存数天或数周，保持其原始形态和功能。
• 现在已经不用器官培养了。

外植体培养

• 在这种方法中，切碎的组织成分作为外植体嵌入血浆凝块中。
• 此前，腺样组织外植体培养用于分离腺病毒。这种方法现在在病毒学中很少使用。

细胞培养

• 细胞培养现在常用来培养病毒。
• 在该方法中，通过用蛋白水解酶（胰蛋白酶或胶原蛋白酶）处理组织成分细胞，然后机械摇动。
• 然后细胞被洗涤、计数，并悬浮在含有必需氨基酸和维生素、盐、葡萄糖和缓冲系统的生长介质中。该培养基添加高达5%的胎牛血清和抗生素。
• 细胞悬液装在玻璃或塑料瓶、桌子或培养皿中。
• 在孵育时，细胞粘附在玻璃表面上并分开以形成覆盖一周内表面的汇合单层细胞片。
• 可以将细胞培养物作为文具培养物或作为辊滚筒培养物孵育。由于通过在特殊滚筒鼓中滚动TheCulture瓶，因此后者对于一些尖端的病毒的生长是有用的。
• 细胞培养物根据其来源、染色体特征和可维持的代数分为三种不同类型。

基本的细胞培养:

• 这些是从原始组织中获得的正常细胞培养，这是第一次在体外培养并且没有被转移的。
• 这些细胞培养可以从整个动物胚胎或从成人、新生儿或胚胎的选定组织中建立。
• 这些细胞具有正常的二倍体染色体数，并且能够仅在培养中有限（5-10个部门）。
• 不能连续培养，但可以传代培养获得大量细胞。
• 原代细胞培养常见的有猴肾细胞培养、人胚胎肾细胞培养和鸡胚细胞培养。
• 猴肾细胞原代培养对粘液病毒、副粘病毒、许多肠道病毒和一些腺病毒的原代分离非常有用。

二倍体细胞的特性:

• 二倍体细胞株是一种保持原来二倍体染色体数目和核型的单细胞类型。然而，它们有特定的特征和组成，通常由一种基本细胞类型组成。
• 它们通常是成纤维细胞，并且可以在它们经历衰老（灭鼠）或经历其特征的显着变化之前培养最多50个串行通道。
• 取自人成纤维细胞的二倍体细胞可用于分离某些挑剔病毒。
• 它们也用于生产疫苗;例如，Wi-38人胚胎，肺细胞茎用于培养固定的狂犬病病毒，以及人胎儿二倍体细胞，用于分离腺病毒，小型病毒，HSV，CMV和VZV。

连续细胞系:

• 连续或不朽的细胞系是单一类型的细胞，其衍生自癌组织，并且能够无限期地在没有参培的情况下连续进行连续培养。
• 这些细胞通常来自二倍体细胞系或恶性组织，染色体数目改变和不规则。
• 永生可以自发发生，也可以由化学诱变剂、致瘤病毒或致癌物质诱导。从人宫颈癌、人喉癌、人鼻咽癌等细胞系中提取的Hep-2、HeLa和KB对大量病毒的恢复是极好的。
• 这些细胞系已广泛用于许多病毒的生长。这些细胞系通常储存在-70℃，以在必要时使用或通过串行亚培养来维持。
• 用于病毒培养的细胞系类型取决于细胞对特定病毒的敏感性;例如，HEP-2细胞系非常适合于回收呼吸道合胞病毒，腺病毒和HSV。
• 大多数病毒可以通过使用其中一种细胞系来分离。
• 通过以下方法可以检测细胞培养物中病毒的生长：

细胞病变效果：

• 许多病毒可以通过观察它们在培养细胞中复制时的形态变化来检测和初步鉴定。
• 不同类型病毒产生的CPE是特征，有助于病毒分离株的初始鉴定。
• 细胞核收缩、胞浆内空泡、合胞体形成、圆缩和分离是细胞形态改变的例子。
• 在低倍镜下，大多数cpe可在未固定和未染色的单层细胞中显示。
• 例如，腺病毒产生类似葡萄串的大颗粒变化，SV-14产生明确的细胞质空泡化，麻疹病毒产生合胞体形成，疱疹病毒产生离散的局灶性变性，肠道病毒引起细胞的增生和整个细胞薄片的变性。

红细胞吸附:

• 血液吸附是将红细胞吸附到感染细胞表面的过程中，其用作病毒蛋白合成的间接测量。
• 该特性是用来检测非胞菌病毒的感染以及细胞癌病毒的早期阶段。
• 流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒和披膜病毒等病毒在感染细胞系时表达红细胞凝集素，这些凝集素在感染时表达于受感染的细胞膜上。
• 这些血凝素使一些红细胞与受感染细胞表面结合。
• 有时，可以通过培养基中的红细胞凝集来检测病毒。

异源干扰：

• 此属性用于检测在单元格中不会产生经典CPE的病毒。
• 在该方法中，细胞培养中的非CPE产生病毒的生长可以通过随后用众所周知的病毒制备CPE的病毒来测试。
• 第一种病毒的生长将通过干扰抑制细胞病变病毒的感染。
• 例如，风疹病毒通常不会产生任何CPE，但可以阻止小核糖核酸病毒的复制，而小核糖核酸病毒是作为细胞病变挑战病毒接种的。

转换:

• 与肿瘤形成相关的致癌病毒诱导感染细胞系中的细胞转化和接触抑制的丧失。
• 这导致表面生长，并以堆积的方式产生微肿瘤。
• 在细胞系中产生转化的致癌病毒的例子有一些疱疹病毒、腺病毒、肝病毒、乳头状病毒和逆转录病毒。

光学显微镜:

• 病毒抗原是通过与辣根过氧化物酶结合的特异性病毒抗体对组织切片的病毒感染细胞进行染色来证实的。
• 随后加入双氧水和联苯胺衍生物。
• 在阳性反应中，在细胞系上沉积红色不溶性沉淀物，其通过在普通光学显微镜下进行检查。

免疫荧光法:

• 利用特异性抗体直接免疫荧光法检测接种细胞系中的病毒抗原，以鉴定病毒。

电子显微镜:

• 这些病毒也可以通过电镜在被感染的细胞系中得到证实。

参考

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