最可能数水质分析(MPN)

最可能数(MPN)分析是一种基于给定样品中每体积微生物的随机分布的统计方法。

• 在这种方法中，测量体积的水被添加到一系列含有液体指示生长介质的管中。
• 接受一个或多个指示细菌的培养基显示生长和特有的颜色变化。这种颜色变化在那些只接种了没有指示细菌的水的人身上是没有的。
• 根据阳性和阴性反应的数量和分布，可参考统计表估计样品中指标生物的MPN。
• MPN测试分三个步骤完成:
  1. 假定测试
  2. 确认测试
  3. 完成测试

图片来源:微生物在网上和Scharlab．

假定测试

该测试是大肠菌菌细菌的特异性富集程序，在填充有选择性生长培养基（Macconkey乳糖肉汤）的发酵管中进行，其含有倒的Durham管用于检测发酵气体。用测量量的水样品接种一系列乳糖肉汤管。一系列管可以由三个或四组三，五个或更多个管组成。

在培养基中发现的主要选择因子是乳糖，有时是表面活性剂如Na-月桂基硫酸盐或Na-Taurocholate（胆汁盐），通常是pH指示剂染料，用于促进酸生产的检测，如溴酚紫色或辉煌的绿色。发生乳糖的选择性作用，因为许多细菌不能发酵这种糖，而大肠杆菌和其他几种细菌类型都可以发酵。表面活性剂和染料不抑制大肠菌菌，而许多其他细菌（例如孢子成型剂）被抑制。

确认测试

当获得阳性或可疑的假定试验时，该试验用于确认大肠菌群的存在。

1. 一圈生长物从这样一个假定的试管转移到一个亮绿色乳糖胆汁(BGLB) 2%的培养液(或其他乳糖培养液)中，并在35°C下培养48小时。这是一种检测水、乳制品和其他食品中的大肠菌群的选择性培养基。培养基中的一种选择剂是乳糖。肉汤管还包含一个达勒姆管，用于检测气体的产生。
2. 在LES Endo琼脂(或EMB琼脂)培养皿上划线，从阳性试管中培养出一圈生长物，在35℃下培养18-24小时。典型大肠菌群(大肠杆菌和肠杆菌属aerogenes)在这种培养基上生长良好，形成红色至黑色的菌落，中心较暗或有光泽。伤寒沙门氏菌生长良好，但菌落是无色的。金黄色葡萄球菌生长完全被抑制了。

完成测试

该测试有助于进一步确认可疑的，如果需要，阳性的确认测试结果。将LES Endo琼脂平板上的典型大肠菌群接种到一根亮绿色的胆汁液管中，并置于倾斜的营养琼脂表面。然后在35°C下孵育24小时。24小时后，检查肉汤是否产生气体，并从营养琼脂斜面上的微生物进行革兰氏染色。如果该微生物是革兰氏阴性的、不产生孢子的杆状体，并且在乳糖管中产生气体，那么在水样中存在大肠菌群就是阳性的。

最可能数字(MPN)目标

• 用MPN法计数饮用水中存在的细菌数量。
• 以确定饮用水样本中的细菌。

最大可能数程序

即假定测试

图片来源:微生物在网上

1. 用达勒姆管和高压釜在试管中制备单强度和双强度麦康基紫色介质。
2. 取三组试管，每组5个试管;一套含10毫升双剂量(DS)，另两套含10毫升单剂量(SS)。
3. 使用无菌移液管，转移10毫升水到每个DS肉汤管。转移1毫升水样到每5管一套SS肉汤和转移0.1毫升水到5管剩余的最后一套SS肉汤管。
4. 37℃孵育试管24小时。
5. 孵育后，观察达勒姆管中气体的产生和介质的颜色变化。
6. 记录每一组阳性结果的数量，并与标准图表进行比较，以给出每100毫升水样推定的大肠菌群计数。

2确认测试

大肠杆菌以外的一些微生物也通过乳糖发酵产生酸和气体。为了确认大肠菌群的存在，需要进行确认试验。为此，从阳性试管中取一圈悬液接种到3ml乳糖培养液或亮绿色乳糖发酵管中，并接种到琼脂平板(EMB琼脂或Endo琼脂)或斜平板上。

接种乳糖汤

1. 37°C孵育接种的乳液发酵管，24±2小时后检查气体形成情况。
2. 如果没有发现产气，进一步孵育最多48±3小时检查产气情况。

B.接种介质倾斜

1. 从阳性试管中取一圈悬液，接种于琼脂表面。
2. 琼脂斜体37℃孵育24±2小时。
3. 殖民地必须从宏观上加以考察。

III。完成测试

1. 将典型的大肠杆菌从琼脂平板转变为绚丽的绿色胆汁肉汤，放置Durham的管，并在营养琼脂倾斜的表面上。
2. 在35°C孵育24小时。
3. 24小时后，检查肉汤是否产生气体，并在营养琼脂斜面上对微生物进行革兰氏染色。

最可能数目(MPN)结果

答:假定测试

积极的:达勒姆管在24 - 48小时内形成10%或更多的气体，加上生长介质的浑浊度和介质的颜色变化，构成了大肠菌群的阳性推定试验，从而可能有粪便污染。

• 这种测试只是假定的，因为在这些条件下，其他几种类型的细菌也会产生类似的结果。

消极的：达勒姆管中没有气体生长或形成。

b .确认测试

积极的:乳糖肉汤中气体的形成和EMB琼脂上大肠菌群样菌落的显示表明在检查的样品中存在大肠菌群的成员。

大肠菌群产生带有绿色金属光泽的菌落，与非大肠菌群菌落区分开来(没有光泽)。在高温(44.5±0.2)下出现典型的菌落表明存在耐热性大肠杆菌。

消极的：在乳糖培养基中没有形成气体或在EMB琼脂上没有显示大肠菌群样菌落。

完成测试

积极的:亮绿色的胆汁液管中存在气体和NA斜面上革兰氏阴性、非孢子形成棒的存在，构成了大肠菌群存在的完整试验的阳性，这进而推断水样可能被粪便物质污染。

消极的：在肉汤中没有生长和气体形成。革兰氏染色无革兰氏阴性、无孢子棒。

使用最可能的数字（MPN）

• 它通常用于估算土壤、水、农产品中的微生物种群。
• 该技术特别适用于含有干扰平板计数计数方法的颗粒物质的样品。
• 它也被建议作为一种备选方法的考虑趋势环境监测研究。
• 它也有助于计数细菌不情愿地形成菌落在琼脂平板或膜过滤器但在液体介质中很容易生长。

“最可能数字”的优势

• 易于解释，无论是通过观察或瓦斯涌出
• 样品毒素被稀释
• 分析沉积物、污泥、泥浆等高混浊样品的有效方法。
• 允许样品不能被分析膜过滤．

最大可能数(MPN)限制

• 与MPN计数相关的差的准确性和精度通常意味着该方法是最后的度假胜地之一 - 仅在其他计数方法时被视为不合适。
• 在材料、玻璃器皿和孵化器空间方面既费力又昂贵。
• 它具有相对较大的错误边际。

参考

1. 卡布奇诺J.G.和谢尔曼N. 2008。《微生物学:实验室手册》第8版。皮尔逊·本杰明·卡明斯，旧金山，美国
2. http://microbiol.org/wp-content/uploads/2010/12/sutton.jvt_.16.3.pdf.
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC92996/
4. https://www.slideshare.net/prakashtu/bacteriological-analysis-of-drinking-water-by-mpn-method
5. https://microbeonline.com/probable-number-mpn-test-principle-procedure-results/
6. http://fire.biol.wwu.edu/brodham/biol346_S07/labman_week9b.pdf