Western遮挡定义，原理，步骤，结果，应用

经过

Western Blot.定义

蛋白质印迹还称为免疫印迹，是分离蛋白质并将它们鉴定在复杂的生物样品中的过程。

  • 聚丙烯酰胺凝胶电泳的用途是蛋白质印迹的先决条件，以便在其鉴定之前分离蛋白质。
  • Western Blotting的过程涉及转移SDS分离的蛋白质页进入吸水膜。然后可以通过不同的方法在膜上鉴定蛋白质。
  • Western Blotting彻底改变了使用抗体探针对膜结合蛋白的免疫学领域。
  • 蛋白质的免疫缩放在生物化学和其他科学中具有广泛的应用，因为它可以检测和表征多种蛋白质。
  • 该方法的敏感性取决于加工过程中蛋白质的转移保留效率和最终检测。
  • 蛋白质印迹或蛋白质印迹取决于感兴趣的蛋白质与用于检测蛋白质的探针之间的相互作用的特异性。
  • 与利用无线电标记的核酸探针的Southern印迹不同，Western印迹通常使用标记用酶标记的第二抗体。
  • Western印迹具有与其他类似技术的许多优点，因为该过程仅需要使用少量试剂，并且相同的蛋白质转移可用于多种分析。

虫幕印迹原则

  • 蛋白质印迹原理是蛋白质与用于检测蛋白质的探针之间的相互作用。
  • 用于蛋白质印迹的蛋白质通过凝胶电泳分离，得到它们在凝胶基质上。
  • 然后将蛋白质转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，在那里它们固定。蛋白质的转移称为印迹。
  • 膜上的蛋白质可以通过使用针对蛋白质的报告标记的一抗，或者在一抗蛋白质的报告标记的二抗。
  • 存在于抗体上的报告或探针可以是在抗原抗体结合位点处产生颜色反应或发光信号的酶，其在特定基材存在下产生荧光信号。
  • 由探头产生的信号或颜色需要适用于产生的信号或强度的检测系统。

Western Blot的要求

凝胶电泳

  • 凝胶（NUPAGE）
  • 基本电源
  • 样本缓冲器
  • 加热块
  • 样品还原缓冲区
  • 预染色蛋白梯

蛋白质转移

  • 迷你型造型由罐，盖子和污点模块组成。组件与冷却冰一起储存，使其在需要时被冷冻。
  • 0.45μm硝化纤维素滤纸
  • NUPAGE转移缓冲器
  • 甲醇
  • 方形吡克斯菜
  • 方形一次性塑料培养皿
  • razorblade和凝胶刀
  • 基本电源

Western Blotting.

  • 10x Tris缓冲盐水，1％吐温20。
  • 摇机
  • 10％粉状非奶粉干乳
  • 方形一次性塑料培养皿
  • 塑料袋
  • 脉冲热封器
  • 一抗
  • 与辣根过氧化物酶缀合的二次抗体抵抗一抗宿主物种。
  • 化学发光底物
  • 凝胶文件系统

Western Blot的程序

Western Blotting的过程包括以下步骤;

1.样品制备

  • 用于蛋白质印迹的最常用的样品是通过提取方法收集的细胞裂解物。
  • 萃取可以通过不同的方式实现，如机械破坏，化学提取或酶的使用。
  • 在蛋白酶抑制剂存在下在寒冷温度下在寒冷温度下进行的提取，以防止蛋白质的变性。

凝胶电泳

  • 将蛋白质样品用样品缓冲液稀释，并在70℃下加热并摇动10分钟。
  • 然后将样品以5000g离心。
  • 从袋中取出凝胶盒，并用面向罐储存器的内部的凝胶壁放置在缓冲罐中。
  • 将运行缓冲液倒在上部储存器上，同时确保在下罐上发生缓冲泄漏。
  • 然后将每个孔一起装载等体积的热变性样品，并且其中一个泳道被保留用于蛋白梯子。
  • 盖子放在罐上，它连接到电源。
  • 允许运行以200 V常量运行50分钟。

3.蛋白质转移

  • 通过向缓冲液中加入10％甲醇来制备转移缓冲液。
  • 转移案件是采取和布局的。然后用转移缓冲区覆盖。
  • 泡沫海绵拍摄并放置在后侧，滤纸上方。应该放置这些，以确保它们两者湿润，略微浸没。
  • 凝胶从罐中取出并放在湿滤纸上。
  • 硝酸纤维素膜用转移缓冲液湿润，并以凝胶与膜之间没有气泡的方式置于凝胶的顶部。
  • 将转印箱放入转移槽中，进一步填充转移缓冲液。
  • 然后将罐连接到100V的电力1小时。
  • 一旦转移完成，移除转移箱，并从凝胶中除去硝酸纤维素膜。

4.免疫缩编

  • 用Tris缓冲盐水洗涤膜在培养皿中用5分钟洗涤5分钟。
  • 将10％的非脂肪干乳与Tris缓冲液混合，并在室温下用混合物覆盖膜30分钟。
  • 用TRIS缓冲液洗涤膜以除去残留在膜上的任何过量混合物。
  • 借助于镊子，将膜转移到新的培养皿上，在其上加入初级抗体。
  • 将具有抗体的膜在室温下温育3小时。与TRIS缓冲液温育后，将膜洗涤。
  • 将膜再次转移到新的培养皿中，其中加入第二HRP缀合的抗体。将膜温育1小时。二次抗体的浓度通常保持在1μg/ mL，但这也取决于稀释。
  • 用TRIS缓冲液再次洗涤膜以除去来自表面的过量抗体。
  • 将膜与基材一起温育5分钟，并进行观察。
Western Blot.
Western印迹。使用biorender.com创建

结果解释免疫印迹

  • Western印迹的结果取决于过程中使用的探针的类型。
  • 如果使用酶缀合的二抗，则基材和酶之间的反应产生颜色。
  • 将可溶性染料转化为不溶性形式，在膜上产生不同的颜色。
  • 为了停止发出印迹，通过洗涤膜除去染料。
  • 然后可以通过分光光度法评估蛋白质水平。

Western Blot的应用

  1. 蛋白质印迹是一种高灵敏度的优异方法，以便在低量中检测特定的蛋白质。
  2. Western Blotting已用于不同疾病的临床诊断。通过检测血清中的抗HIV抗体，HIV的确认测试涉及蛋白质印迹。
  3. 该技术已用于量化基因表达研究中的蛋白质和其他基因产物。
  4. 由于蛋白质印迹通过其尺寸和结合抗体的能力来检测蛋白质，因此在蛋白质纯化期间评估细胞中的蛋白质表达和进一步分析蛋白质级分是适当的。
  5. Western Blotting还用于分析不同生物标志物，如生长因子，细胞因子和荷尔蒙。

Western Blot的局限性

  1. 由于它是一个非常敏感的过程，因此该过程中的任何不平衡都会影响整个过程的结果。
  2. 在某些情况下，由于蛋白质的转移不充分，没有可能观察到带或错误的带。
  3. 测试只能用作半定量测试，因为估计并不总是精确。
  4. 该过程是耗时和复杂的，因此只能由训练有素的人员进行。
  5. 如果蛋白质的一抗体可用，则只能对蛋白质进行蛋白质印迹。
  6. 通过在样品中与多于一种蛋白质相互作用，一些抗体可能表现出偏离目标效果。
  7. 该技术是具有抗体成本和昂贵的检测方法的昂贵过程。
  8. 小蛋白质可能不会被膜保留，而较大的蛋白质难以转移到膜上。

参考

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来源

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