什么是Western Blotting？

介绍

Western Blot是分子生物学，免疫原性和其他分子生物学中使用的分析技术，以检测组织均匀化或提取物样品中的特定蛋白质。作为南方印迹相似的程序，称为Western Blotting。虽然Southern印迹进行了检测DNA，但为检测蛋白质进行蛋白质印迹。蛋白质印迹也被称为蛋白质免疫印迹，因为抗体用于特异性地检测其抗原。

蛋白质印迹原理

该技术由三个主要流程组成：

1. 用尺寸（电泳）分离蛋白质。
2. 转移到固体支持（印迹）
3. 用适当的初级和次级抗体标记靶蛋白以可视化（检测）。

电泳用于根据其电泳迁移率分离蛋白质，这取决于蛋白质分子的电荷，尺寸和蛋白质的结构。蛋白质从凝胶内移动到由硝酸纤维素（NC）或聚偏二氟化乙烯（PVDF）制成的膜上。没有预活化，蛋白质基于疏水性相互作用与硝酸纤维素膜结合（斑点）。用于检测蛋白质，使用一抗抗体和酶缀合的二抗。在基板中，基材与酶反应，该酶与二抗结合以产生有色物质，即可见蛋白质带。

在该技术中，蛋白质的混合物基于分子量分离，因此通过型通过凝胶电泳分离。然后将这些结果转移到产生每个蛋白质的膜中。然后将膜与特异于目的蛋白质的标签抗体孵育。洗涤未结合的抗体，仅留下与感兴趣的蛋白质的结合抗体。然后通过显影膜来检测结合的抗体。由于抗体仅与感兴趣的蛋白质结合时，只能看到一个频段。带的厚度对应于存在的蛋白质的量;因此，制定标准可以表明存在的蛋白质。

Western Blotting通常在组织匀浆或提取物上进行。它利用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳），一种凝胶电泳，首先将各种蛋白质在混合物中的形状和尺寸的基础上分开。由此获得的蛋白质带转移到a硝酸纤维素或尼龙膜在其中用特异于待检测的蛋白质的抗体“探测”。在含有抗体识别的蛋白质的带上形成的抗原抗体复合物可以以各种方式可视化。

如果感兴趣的蛋白质是通过放射性抗体的束缚，则可以通过将膜暴露于X射线膜片材中的印迹上的位置来确定，这是一种称为X射线膜的方法auteradoography.。然而，最普遍使用的检测程序使用酶联抗体对蛋白质。在结合酶 - 抗体缀合物之后，加入产生高色和不溶性产物的发色基质导致靶抗原位点的彩带的外观。如果使用化学发光化合物以及合适的增强剂在抗原位点产生光，则可以以更高的敏感性确定感兴趣的蛋白质。

蛋白质印迹的应用

1. 鉴定蛋白质混合物中的特定蛋白质。在该方法中，通过SDS-PAGE分离明确定义的分子量的已知抗原并呈涂硝基纤维素。然后将已知抗原的分离带用涉嫌含有特异于这些抗原中的一种或多种特异的抗体的样品。通过使用对试样中抗体的种类特异的放射性标记或酶联的二抗来检测抗体与带的反应。
2. 估计蛋白质的大小以及混合物中存在的蛋白质的量。
3. 它是最广泛应用于艾滋病毒诊断的确认测试，其中该过程用于确定患者是否具有与一种或多种病毒蛋白反应的抗体。
4. 血清血清特异性抗体的示范，用于诊断神经细胞术和结核性脑膜炎。