表的内容
- 脱氧核糖核酸(DNA)提取是将DNA从细胞中所含的蛋白质、膜和其他细胞物质中分离出来的过程。
- 最简单的细胞，如细菌细胞，是原核生物。这些原核生物由脂质双分子层、外膜和含有环状染色体的细胞质、蛋白质、无机盐和金属离子、糖分子和其他细胞机制元素组成。
- 从真核细胞和原核细胞中高效分离高纯度DNA的大量不同的方法是存在的。
- 许多可用的DNA提取程序都有共同的元素。事实上，提取DNA通常遵循三个基本步骤:
- 裂解细胞。
- 将DNA从其他细胞成分中分离出来。
- 孤立的DNA。
苯酚-氯仿提取DNA
苯酚-氯仿萃取是液-液萃取。液-液萃取是一种基于单个分子在两种不同的不混溶液体中的不同溶解度来分离分子混合物的方法。液-液萃取法广泛用于分离RNA、DNA或蛋白质。提取核酸需要在溶解细胞或均质组织的水溶液中加入等量的苯酚-氯仿，将两相混合，并通过离心分离。混合物的离心产生两相:较低的有机相和较高的水相。
原则
- 所使用的生物体应在适宜的培养基和最适的温度下生长，并应在后期至早期稳定期采收，以获得最大产量。
- 基因组DNA分离需要从RNA、蛋白质、脂类等中分离总DNA。
- 为了在提取缓冲液中释放DNA，首先必须破坏细胞膜。十二烷基硫酸钠(SDS)被用来破坏细胞膜。
- 一旦细胞被破坏，内源性核酸酶往往引起广泛的水解。利用EDTA螯合Mg2++离子可以保护DNA免受内源性核酸酶的伤害。Mg2++离子被认为是大多数核酸酶作用的必要辅助因子。
- 核蛋白相互作用被SDS、苯酚或蛋白酶K破坏。
- 蛋白酶被用来降解被破坏的细胞液中的蛋白质。
- 苯酚和氯仿被用来使蛋白质变性并从DNA中分离出来。氯仿也是一种蛋白质变性剂，它稳定了水相和纯酚层之间相当不稳定的边界。
- 变性蛋白在水相和有机相之间的界面上形成一层，通过离心去除。
- 从受损细胞中释放的DNA用冷无水乙醇或异丙醇沉淀。
材料和试剂
- 三羟甲基氨基甲烷基液
- 蛋白酶K
- 苯酚、氯仿(1:1)
- 200证明乙醇
- 核糖核酸酶
- 乙醇
- SDS
- 乙二胺四乙酸
- 胰蛋白胨
- 酵母提取物
- 生理盐水
- LB培养基
- TE缓冲
- 裂解缓冲
设备
- 台式离心机
- 1.5 ml Eppendorf管
- 孵化器
过程
- 转移1.5毫升隔夜溶液大肠杆菌在LB培养基中培养至1.5 ml Eppendorf试管中，以最快速度离心1min至成球。
- 将上清倒出，不要扰乱细胞颗粒。
- 细胞颗粒在600 μl裂解缓冲液中重悬，漩涡使细胞颗粒完全重悬。
- 37°C孵育1小时。
- 加入等量的苯酚/氯仿，将管子倒转，直到两相完全混合。
- 在室温下以最大速度旋转5分钟(所有旋转均在室温下进行，除非另有说明)。在苯酚/氯仿的水界面上有一个白色层(蛋白质层)。
- 用1ml移液器小心地将上面的水相转移到一个新的管中(为避免吮吸接口，使用1ml尖嘴较宽的尖嘴，将1ml尖嘴较短约2mm)。
- 重复步骤4-6，直到白色蛋白层消失。
- 要除去苯酚，向水层中加入等量的氯仿。再次，通过倒转管子混合。
- 以最大速度旋转5分钟。
- 将水层移到新管上。
- 为了沉淀DNA，加入2.5或3体积的冷200度乙醇(在-20°C冰箱中储存乙醇)，并轻轻混合(可以看到DNA沉淀)。
注:DNA沉淀可能是单纯的弥散，这是正常的。保持试管在-20度至少30分钟(越长越好)，然后旋转下来(参见步骤15-16)。你应该看看DNA颗粒。湿的时候是透明的，干的时候是白色的。 - 试管在-20°C孵育30分钟或更久。
- 在4°C下以最大速度旋转15分钟。
- 弃掉上清，用1ml 70%乙醇冲洗DNA颗粒(RT保存)。
- 以最大速度旋转2分钟。小心丢弃上清液，风干DNA颗粒(将试管在纸巾上倾斜一点)。为了更快，在37°C的培养箱中干燥试管。
- 在TE缓冲液中重悬DNA。
注:大量的RNA将存在于DNA样本中。因此，对于后续反应，例如消化质粒DNA，在消化液中加入1-5 μl (1 mg ml-1)的RNA酶，完全去除RNA。或者直接将rnase加入裂解缓冲液中，最终浓度为1 mg ml-1。 - 分离的基因组DNA可以进行琼脂糖凝胶电泳。
预期结果
- 白色的DNA链沉淀。
- 在凝胶上，可以看到从高分子量到低分子量范围的涂片图案。
- 大多数DNA片段在高分子量时积累:未降解。
- 大多数DNA片段很小:DNA可能已经被降解了。
参考文献
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