缓冲器和提取缓冲器

• 缓冲液是由弱酸和它的盐(酸性缓冲液)或弱碱和它的盐(碱性缓冲液)的混合物组成的水溶液，它能抵抗酸碱添加时pH值的变化。
• 当加入少量强酸或强碱时，它的pH值变化很小，因此它被用来防止溶液pH值的变化。
• 实际上，缓冲溶液由弱酸和它的共轭碱的水溶液混合物组成。
• 共轭碱组分会中和实验中产生的任何氢离子，而未化酸则会中和实验中产生的任何碱。

提取缓冲

提取缓冲液，有时也被称为裂解缓冲液，是一种缓冲溶液，用于在分子生物学实验中分析细胞的化合物。

大多数裂解缓冲液含有盐来调节裂解液的酸度和渗透压。

• 通常萃取缓冲液的离子强度(0.1-0.2 M)和pH值(7.0-8.0)被认为与细胞内发现的相容。
• 三磷酸或磷酸缓冲液是最常用的。
• 每种缓冲液的选择都有一个特定的pH范围，所以缓冲液的选择要根据目标物质在一定的pH下是否稳定。
• 此外，对于pH范围相似的缓冲液，重要的是要考虑缓冲液是否与细胞的目标成分兼容。

提取缓冲区的组成部分

为了特定的目的，缓冲液中还可以包含一系列其他的试剂。这些包括:

1. 一种抗氧化剂

• 在细胞内，蛋白质处于高度还原的环境中，但当释放到缓冲区时，它暴露在更氧化的环境中。
• 由于大多数蛋白质含有大量的游离巯基(来自氨基酸半胱氨酸)，这些基团可以通过氧化形成分子间和分子内的二硫化物桥。
• 为了防止这种情况发生，还原剂如二硫苏糖醇、b-巯基乙醇、半胱氨酸或还原性谷胱甘肽通常都包含在缓冲液中。

2. 酶抑制剂

• 一旦细胞被破坏，蛋白质就会水解酶在完整的细胞中被精心包装和控制的蛋白质被释放出来，可能会开始降解提取物中的蛋白质，包括感兴趣的蛋白质。
• 为了减缓不必要的蛋白质水解，所有提取和纯化步骤都在4^o此外，在缓冲液中还含有一系列蛋白酶抑制剂。
• 抑制剂的常见例子包括:二异丙基氟化磷酸(DFP)、苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯苯丙酰氯甲基酮(TPCK)(所有丝氨酸蛋白酶抑制剂);碘乙酸和胱抑素(硫醇蛋白酶抑制剂);胃抑素(天冬氨酸蛋白酶抑制剂);EDTA和1,10-菲罗啉(金属蛋白酶抑制剂);以及阿司他汀和贝司他汀(外肽酶抑制剂)。

3. 酶底物和辅助因子

• 当酶被纯化时，提取缓冲液中通常包含低水平的底物，因为底物与酶活性位点的结合可以在纯化过程中稳定酶。
• 在相关情况下，在纯化过程中可能丢失的辅助因子也包括在内，以维持酶的活性。

4. 乙二胺四乙酸

• 这可以去除二价金属离子，这些金属离子可以与蛋白质中的硫醇基团反应产生硫醇。

5. 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)

• 这通常被添加到植物组织的提取缓冲液中。
• 植物组织中含有大量的酚类化合物，它们可以通过非共价力(包括疏水、离子键和氢键)与酶和其他蛋白质结合，导致蛋白质沉淀。
• 不溶性PVP(模拟多肽骨干)因此被添加到吸附酚类化合物，然后可以通过离心去除。
• 硫醇化合物(还原剂)也被加入，以减少酚氧化酶的活性，从而防止醌的形成。

6. 叠氮化钠

• 对于要长时间储存的缓冲液，抗菌和/或抗真菌剂有时在低浓度添加。
• 叠氮化钠常被用作抑菌剂。

提取缓冲区的意义

• 裂解缓冲液的主要作用是分离出感兴趣的化合物并使其保持在稳定的环境中。
• 由于许多生物化学分子是弱电解质，其离子状态随ph值的变化而变化，因此在实际的生化工作中，离子状态的稳定是非常重要的。

参考文献

1. (2018)。生物化学与分子生物学原理与技术(8编)。剑桥大学出版社:纽约。
2. https://en.wikipedia.org/wiki/Lysis_buffer
3. https://slideplayer.com/slide/8257102/
4. https://fac.ksu.edu.sa/sites/default/files/unit_5_-_buffer_solutins_ _subjects_0.pdf
5. http://www.chem.cmu.edu/courses/09-106/notes/buffers.pdf