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竞争力的ELISA是一种用于估计标本(如血清)中抗体的技术。
- 使用测试原理是，使用两种特异性抗体，与酶缀合的一种，并且存在于试验血清中（如果血清为抗体阳性）。
- 两种抗体对同一抗原发生竞争。
- 有颜色表示阴性(无抗体)，没有颜色表示阳性(有抗体)。
- 竞争性ELISA的核心事件是原始抗原(样本抗原)和添加抗原的竞争性结合过程。
- 与其他形式的酶联免疫吸附试验相比，竞争酶联免疫吸附试验在某些方面有所不同。
竞争酶联免疫吸附试验步骤/过程
- 一抗(未标记)与样本抗原孵育。
- 然后将抗体-抗原复合物添加到预涂有相同抗原的孔板中。
- 通过清洗培养皿去除未结合的抗体。(样本中的抗原越多，能够与孔中的抗原结合的抗体就越少，这就是“竞争”。)
- 加入一抗特异性的并与酶结合的二抗。
- 添加底物，剩余的酶引出显色或荧光信号。
- 在这个测试中，微量滴度孔被抗原包裹。
- 将待测血清加入这些孔中，在37℃下孵育，然后洗涤。
- 如果检测血清中有抗体，就会发生抗原-抗体反应。
- 通过添加酶标记的特异性抗体来检测抗原抗体反应。
- 在阳性测试中，没有抗原留给这些抗体发挥作用。
- 因此，抗体保持自由并在洗涤过程中洗去。
- 当添加底物时，没有酶可以作用于底物上。
- 因此，没有显色反应即为阳性结果。
- 在阴性试验中，血清中不存在抗体，包被孔中的抗原可与酶偶联抗体结合，酶作用于底物产生颜色。
的优点竞争力的ELISA
- 高特异性，因为使用两种抗体和抗原/分析物被特异性捕获和检测
- 适合于复杂的样品，因为抗原不需要净化前测量
- 灵活性和灵敏度，因为直接和间接检测方法都可以使用
协议的竞争力的ELISA
对于大多数应用，最佳聚氯乙烯（PVC）微量滴定板是最好的。
- 每孔加50 μL稀释后的一抗(捕获抗体)。孵育4小时。在室温或4°C下过夜。
注:如果没有纯化的捕获抗体，应先用纯化的二抗包覆平板，根据以下程序针对捕获抗体的宿主：
- 通过向每个孔（20μg/ ml在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入大约50μl抗体溶液，将未标记的次级抗体与每个孔的底部结合。
- 在4°C孵育过夜，使其完全结合。
- 添加初级捕获抗体（如上所述）。
- 用PBS冲洗孔两次。抗体溶液洗涤可以通过轻弹盘子在一个合适的容器。
- 蛋白质结合在微量滴定板上的剩余部位必须通过与阻塞缓冲液孵育而饱和。用0.02％叠氮化钠用3％BSA / PBS填充孔。孵育2小时。在室温下在潮湿的气氛中过夜。
- 用PBS洗涤井两次。
- 在孔中加入标准品或样品溶液50 μL。所有稀释都应在阻断缓冲液中进行(3% BSA/PBS + 0.05% Tween-20)。
注意:叠氮化钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。如果将使用酶标共轭物进行检测，则不要在缓冲液或洗涤溶液中包括叠氮化钠。
- 在孔中加入50 μL抗原结合液(抗原溶液需滴定)。所有稀释都应在阻断缓冲液中进行(3% BSA/PBS + 0.05% Tween-20)。至少孵育2小时。在室温潮湿的环境中。
- 用PBS清洗盘子四次。
- 添加底物。在建议的孵育时间过去后，可以在ELISA阅读器上测量目标波长的光密度。