聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

表的内容

通过电泳琼脂糖或者聚丙烯酰胺凝胶是一种用于分离、识别和纯化生物聚合物的标准方法，因为这两种凝胶本质上都是多孔的。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺与交联剂(通常是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺)聚合而成的化学交联凝胶。
该反应为自由基聚合，通常以过硫酸铵为引发剂，N,N '，N ' -四甲基乙二胺(TEMED)为催化剂进行。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种广泛应用于生物化学、法医化学、遗传学、分子生物学和生物技术等领域的技术，根据生物大分子(通常是蛋白质或核酸)的电泳迁移率来分离生物大分子。
最常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳形式是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)，主要用于蛋白质分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理(PAGE)

SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，是一种分析方法，用于分离蛋白质混合物的成分基于它们的大小。

该技术的原理是，带电分子在电场中向极性相反的电极迁移。一般的电泳技术不能用来确定生物分子的分子量，因为凝胶中物质的流动性取决于电荷和大小。

为了克服这一点，生物样品需要经过处理，使它们获得均匀的电荷，然后电泳迁移率主要取决于大小。因此，不同形状和大小的蛋白质分子需要变性(在SDS的帮助下完成)，使蛋白质失去二级、三级或四级结构。被SDS覆盖的蛋白质带负电荷，当被装载到凝胶上并置于电场中时，它将迁移到阳极(带正电的电极)，并根据大小通过分子筛分作用将其分离。通过染色(蛋白质特异性)技术可视化后，可以通过比较其与已知分子量阶梯(标记物)的迁移距离来计算蛋白质的大小。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求

丙烯酰胺溶液(用于溶解和堆积凝胶)。
异丙醇/蒸馏水。
凝胶加载缓冲区。
运行缓冲。
染色,使脱色的解决方案。
蛋白质样品
分子量标记。

进行SDS-PAGE所需的设备和用品包括:

电泳室和电源。
玻璃板(一个短板和一个顶板)。
铸造框架
铸造站
库姆斯

聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤

样品制备

样品可以是任何含有蛋白质或核酸的物质。
如果需要，可选择将分析的样品与化学变性剂混合，通常为蛋白质的SDS或核酸的尿素。
SDS是一种阴离子洗涤剂，它能使二级结构和非二硫连接的三级结构变性，并按其质量的比例对每个蛋白质施加负电荷。尿素破坏核酸碱基对之间的氢键，导致组成链退火。将样品加热到至少60°C进一步促进变性。
可在溶液中加入跟踪染料。这通常具有比分析物更高的电泳迁移率，以允许实验者在电泳运行期间通过凝胶跟踪溶液的进展。

聚丙烯酰胺凝胶的制备

凝胶通常由丙烯酰胺、双丙烯酰胺、可选变性剂(SDS或尿素)和调节pH值的缓冲液组成。
双丙烯酰胺与丙烯酰胺的比例可因特殊用途而有所不同，但一般约为1 / 35。凝胶的丙烯酰胺浓度也可以变化，一般在5%到25%之间。
低比例的凝胶更适合分解分子量很高的分子，而分解较小的蛋白质则需要高比例的丙烯酰胺，
凝胶通常在凝胶浇铸器中的两块玻璃板之间聚合，并在顶部插入一个梳子来创建样品孔。
凝胶聚合后，梳子可以被移除，凝胶准备进行电泳。

电泳

PAGE中根据样品的性质和实验目标使用不同的缓冲系统。
阳极和阴极使用的缓冲器可能相同，也可能不同。
在凝胶上施加电场，导致带负电的蛋白质或核酸在凝胶上从负极迁移到正极(阳极)。
根据它们的大小，每个生物分子在凝胶基质中的移动方式不同:小分子更容易通过凝胶中的孔隙，而大分子则更难。
凝胶通常运行几个小时，但这取决于施加在凝胶上的电压。
在设定的时间之后，生物分子会根据它们的大小迁移不同的距离。
小的生物分子在凝胶中移动得更远，而大的生物分子则更接近凝胶的起源点。
因此，生物分子可以大致按照大小进行分离，大小主要取决于变性条件下的分子量，但也取决于原生条件下的高阶构象。

检测

电泳之后，凝胶可能被染色(对于蛋白质，最常见的是考马斯亮蓝或放射自显影;核酸用溴化乙锭;银染色)，使分离的蛋白质可视化，或进一步处理(如Western blot)。
染色后，不同物种的生物分子在凝胶中呈现出不同的条带。
常用的方法是将已知分子量的分子量大小标记放在凝胶的单独通道中，以校准凝胶，并通过比较与标记的相对移动距离来确定未知生物分子的近似分子质量。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的应用

测量分子量。
肽映射。
蛋白质大小的估计。
蛋白质亚基或聚集结构的测定。
蛋白质纯度的估计。
蛋白质定量。
监测蛋白的完整性。
不同样品多肽组成的比较。
多肽亚基的数量和大小分析。
后电泳应用，如Western blotting。
考马斯氏G-250无有机溶剂和醋酸对凝胶中蛋白质的染色。
通过重复使用商业卡带灌注和运行蛋白质凝胶。
用CyDye DIGE氟极微量染料选择性标记细胞表面蛋白质。
蛋白质泛素化的检测。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的优点

稳定的化学交联凝胶
更高的分辨率(锐利波段)
能容纳更多的DNA而不显著降低分辨率吗
从聚丙烯酰胺凝胶中提取的DNA非常纯净
通过改变两种单体的浓度，可以很容易且可控地改变聚丙烯酰胺凝胶的孔径。
适用于低分子量碎片的分离

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的缺点

一般比较难制备和处理，涉及的制备时间比琼脂糖凝胶长。
有毒单体
凝胶制作起来很繁琐，而且经常泄漏
每次实验需要新的凝胶稳定的化学交联凝胶

参考文献

http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch07s03.html
https://www.wou.edu/las/physci/ch462/Gel%20Electrophoresis.pdf
https://www.slideshare.net/mbn1994/introduction-principle-instrumentation-and-applications-of-sdspage-55728195
https://en.wikipedia.org/wiki/Polyacrylamide_gel_electrophoresis https://msu.edu/course/css/451/Lecture/PT-electrophoresis%20 (2009) . pdf
http://library.umac.mo/ebooks/b28050459.pdf
http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=186&sim=319&cnt=1

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