RT-PCR:定义，原理，酶，类型，步骤，用途

通过

聚合酶链式反应(PCR)是否使用温度依赖性核酸扩增技术来扩增DNA或核糖核酸体外酶作用。

它是由Kary Mullis和他的同事在20世纪80年代中期开发的，是现代生物学中非常强大和最重要的工具——分子生物学和遗传学。它结合了核酸杂交的原理和核酸复制的原理。使用这种非培养的核酸扩增技术，我们可以在很短的时间内对DNA或RNA的单个片段产生数十亿份拷贝。

自其发展以来，经过了多次修改，现在有不同类型的PCR技术可用于不同的目的。逆转录酶PCR和定量PCR (qPCR)是最常用的PCR类型。

逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)是一种在体外对RNA进行酶扩增的PCR技术。

这是唯一一种可以扩增RNA的PCR。它使用了逆转录酶酶和PCR的其他基本成分。

首先，在逆转录酶的催化下，样本RNA在逆转录过程中转化为互补DNA (cDNA)。在PCR过程中，这些cDNA分子被用作扩增的模板。

RT-PCR用于分析mRNA或微RNA，研究基因表达。

RT-PCR的目的

  1. 放大RNA的特定片段，产生数十亿个单个RNA片段的拷贝。
  2. 诊断某些感染，基因，研究基因表达。

RT-PCR的原理

rt - pcr将反转录过程与传统的PCR过程结合起来。在反转录过程中，样品RNA首先通过逆转录酶转化为双链DNA(互补DNA)。然后，cDNA可以被热分解成两个单链DNA模板。在这些ssDNA模板中，引物可以根据核酸杂交原理退火到它们的互补序列。然后，DNA聚合酶通过在3 '端依次添加核苷酸来延长引物，并遵循DNA复制的原理生成dsDNA。这三个过程，变性、退火和延伸，以循环的方式重复，调节反应温度，产生数百万个cDNA拷贝。

RT-PCR要求(酶)

1.核酸样本(RNA样本)

与其他以DNA为样本的PCR技术不同，RT-PCR的样本是RNA。大部分用mRNA作为样本。RNA在扩增前将被转化为cDNA。

2.逆转录酶

它是一种催化从RNA链形成互补DNA (cDNA)链的酶。它也被称为rna依赖的DNA聚合酶，负责中心原理逆转。它将样本RNA转化为cDNA进行扩增，是RT-PCR的主要组成部分。

3.DNA聚合酶

DNA聚合酶是一种催化互补DNA链合成的酶，它通过按模板链顺序组装核苷酸。Taq DNA聚合酶即从细菌中提取的DNA聚合酶水生栖热菌，是最广泛的DNA聚合酶热稳定，并在加热和冷却的反复循环后继续其活性。

4.引物(Oligo (dT)引物、随机引物、序列特异性引物)

三个不同的引物类型用于RT-PCR;

  1. 随机引物

它们是由6到8个核苷酸组成的短单链序列，结合在含有或不含poly(A)的rna的互补位点，使用逆转录酶合成cDNA。

  1. Oligo (dT)引物

它们是由12 - 18个核苷酸组成的寡核苷酸，包含一段重复脱氧嘧啶(dT)，它结合在mRNA的polyA尾部．

  1. Sequence-specific引物

这些是核苷酸的短单链序列，与样本RNA的特定感兴趣区域结合。它主要用于一步RT-PCR。

5.Deoxynucleotide三磷酸腺苷

脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)是人工合成的核苷酸，在扩增过程中作为合成cDNA和新的cDNA链的构建块。使用4种不同的dntp;脱氧腺苷三磷酸(dATP)，脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)，脱氧胸腺嘧啶三磷酸(dTTP)，脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。

6.PCR缓冲液和其他化学物质

7.Thermocycler (聚合酶链反应机）

RT-PCR的类型

根据逆转录和扩增步骤是在一个反应(或管)中发生，还是在两个单独的反应(或管)中发生，RT- PCR可分为两种类型:

1.一步法rt - pcr

它是RT - PCR的一种，逆转录和扩增反应发生在单管中。所有需要的组件都被添加到一个管中。首先，发生逆转录，形成cDNA，然后在PCR过程中进行扩增。

一步RT - PCR优于两步RT - PCR的优点

  1. 它有一个简单和容易操作的设置。
  2. 具有较高的准确性和特异性。
  3. 它被污染的可能性较小。
  4. 这是一种更便宜、更快的方法。

一步RT-PCR比两步RT-PCR的缺点

  1. 由于在一个反应管中使用多种化学物质，它在每个反应混合物中检测到的模板更少。
  2. 由于较低的模板检测，它需要一个较大的模板来启动。
  3. 它不允许对反应过程中形成的cDNA进行存储和进一步分析。
  4. 引物-二聚体和非特异性结合的几率更高。
  5. 反应失败的几率相对较高。
一步法vs.两步法RT-PCR
一步法vs.两步法RT-PCR

2.两步rt - pcr

它是RT - PCR的另一种，逆转录和扩增过程发生在两个独立的试管中。在第一个试管中，发生反转录反应，生成cDNA。然后这些cdna被转移到另一个加入PCR混合物的试管中，并进行扩增。

两步RT - PCR相对于一步RT - PCR的优势

  1. 它使我们能够储存由逆转录形成的cDNA。
  2. 它有更高的效率，准确性和可靠性，并检测每个反应混合物更大的模板。
  3. 相对而言，反应失败、非特异性结合和引物-二聚体结合的几率较低。

两步RT - PCR比一步RT - PCR的缺点

  1. 污染的可能性更大。
  2. 这是一个更加复杂和繁琐的过程，需要更多的资源和训练有素的人员。

RT-PCR的步骤/步骤

核心程序可以大致分为两个阶段;逆转录和扩增。一步法和两步法RT - PCR的方法也不同。但是，这两种类型所涉及的一般步骤是相同的，可以总结为四个阶段;准备阶段、反转录、扩增和产物分析阶段，即:

1.准备阶段

这是RNA提取的初始阶段，所有的反应混合物都准备好了。首先，整理好所有材料，采取安全措施，清洁PCR反应制备区，将所有试剂调至工作温度，提取或从仓库取出样品。

在一步RT-PCR中，样品RNA，逆转录酶，RNase H，引物，DNA聚合酶，dNTPs，缓冲液和所有其他成分以指定和预先计算的数量添加在一个反应管中。然后将管子装入热循环器进行进一步处理。

在RT-PCR的两步中，样本RNA、逆转录酶、RNase H、引物、dNTPs和其他用于逆转录的缓冲液和化学物质装载在试管中。然后，在热循环器中将该管置于特定的温度下，在那里形成cdna。

2.反转录

这是RNA转化为cDNA的主要步骤，然后进行扩增。

所有反应混合物，包括一步RT-PCR中的逆转录酶、RNase H、dNTPs混合物、引物、无核酸酶水、逆转录缓冲液等组分，以及两步RT-PCR中的DNA聚合酶等扩增组分，均加入管中，置于40 - 50℃的温度下°在热循环器中加热10分钟至30分钟。在这个温度下，引物将结合到RNA样本的各自位点上，逆转录酶将通过加入游离的dNTPs合成cDNA。

3.放大

这一步骤与其他DNA扩增PCR技术的扩增过程相似。在一步RT-PCR中，同样的反应混合物经过一个扩增过程。同时，在两步RT-PCR中，将cDNA分离出来，放入另一个试管中，加入DNA聚合酶、引物、PCR缓冲液、dNTPs和其他化学物质。然后将试管放入热循环器中进行放大。

放大步骤包括变性、退火和延伸，在用户预先编程的一定周期内依次循环发生。

4.产品分析阶段

这是最后一步，对经过聚合酶链反应的反应混合物进行分析，以确认达到了预期的扩增效果。凝胶电泳法主要用于产品分析。在实时RT-PCR中，不需要这一额外步骤。

RT-PCR的应用

  1. 研究基因表达

传统的北方印迹技术需要更大的mRNA样本来分析和研究基因表达。而利用RT-PCR技术，我们可以对微小的mRNA样本进行扩增，并研究核苷酸序列，从而分析基因表达。它被用于研究和识别多药耐药基因及其在病原体中的表达。

  1. 未知物种的鉴定

RT-PCR用于识别病毒，如艾滋病毒，非典病毒，登革病毒，丙型肝炎病毒等。此外，通过研究其他微生物甚至高等生物的rRNA和mRNA可以识别它们。

  1. 传染病诊断

在临床实验室中，利用RT-PCR技术对不同类型的病毒感染、细菌感染、真菌和寄生虫感染、癌细胞和遗传疾病进行诊断。

  1. 基因插入与基因治疗研究

RT-PCR用于从真核mRNA中制备cDNA，真核mRNA缺乏内含子，可以插入原核生物中。RT-PCR用于基因插入和基因治疗的结果监测。这些过程被认为是为了显示特定的基因表达和特定蛋白质的编码，从而翻译特定类型的mRNA序列。这个特定的mRNA序列可以用RT-PCR进行分析。

  1. 研究突变和癌细胞

RT-PCR可以检测和量化组织特异性突变等位基因。它还可以检测到mRNA序列和独特的mRNA的任何不希望的变化，这些变化只由我们体内不同类型的癌细胞产生。

  1. 基因工程和病毒研究的工具

RT-PCR是一种用于分析修饰dna及其转录RNA和扩增目标RNA的基因工程技术。

利用siRNA通过RT-qPCR检测mRNA表达下调
利用siRNA通过RT-qPCR检测mRNA表达下调。

读也:

RT-PCR的优点

  1. 这是一种非常快速的扩增RNA的方法，可以在很短的时间内酶促地产生数百万份mRNA拷贝。
  2. 操作非常简单。该过程是半自动的，由热循环器操作和调节，无需人工参与。
  3. 它具有非常高的特异性和敏感性，但经济。
  4. 这是一种非常准确的方法来识别RNA病毒及其感染。RNA病毒可按株级进行分类。它缩短了识别RNA病毒和病毒感染的时间。
  5. 与传统的Northern Blot技术相比，它可以检测非常微量的mRNA(约5pg)。
  6. 突变基因和基因表达可以很容易和迅速地进行研究。这使得早期诊断癌症、研究基因插入、监测基因治疗结果成为可能。
  7. 这是一种定性和定量的方法;因此可以用来鉴定和量化样本RNA。

RT-PCR的局限性

  1. 它只能放大rna，尤其是信使rna。
  2. 引物设计需要RNA序列的先验信息。
  3. 这是一个全温度和酶基体系，因此反应温度的轻微变化都会降低酶的效率。因此，要求有严格的温度调节系统。
  4. 轻微的污染，具有类似引物结合位点，可以放大，给出假阳性或假阴性的结果。
  5. 反应混合物中极少量的有机或无机污染物会对反应产生很大影响。
  6. 这个过程非常繁琐，需要一个复杂的反应混合物和一个熟练的操作人员。

参考文献

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  6. 逆转录酶(RT)-PCR:原理，应用•微生物在线
  7. 逆转录PCR:原理，程序，协议，优点，局限性，应用
  8. 逆转录系统技术公报TB099
  9. 逆转录PCR (RT-PCR)的基础知识
  10. PCR (cgiar.org)
  11. (PDF)使用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)研究多药耐药细胞|中特定基因的表达

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